Heterologinen tai yhdistelmä-DNA- proteiini on proteiini tuotetaan solu, jonka geneettinen materiaali on muutettu geneettisen rekombinaation .
Geeni, joka koodaa kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia on viety genomiin tuottajan lajien (bakteerit, nisäkässoluja, siirtogeenisiä eläimiä, jne.). Rekombinanttiproteiinit voidaan puhdistaa ja käyttää terapeuttiseen, teolliseen tai jopa tutkimustoimintaan.
Geenien ensimmäinen in vitro-manipulointi alkoi vuonna 1972. Tuolloin biokemisti Paul Berg sai ensimmäisen rekombinantti-DNA: n restriktioentsyymien ansiosta . Vuotta myöhemmin S. Cohen ja H. Boyer onnistuvat viemään sammakkoeläimiä geeneihin Escherichia coli -bakteeriin . Ensimmäinen siirtogeeninen organismi syntyi.
1980-luvulla markkinoitiin ensimmäinen geenitekniikasta saatu tuote. Se on rekombinantti ihmisinsuliini, jota tuottavat geneettisesti muunnetut bakteerit. Tänä aikana tiedemiehet tajusivat myös, että kaikki tällä menetelmällä tuotetut proteiinit eivät olleet toiminnallisia. Tämä ongelma johtuu siitä, että bakteereilla ei ole kaikkia koneita, jotka mahdollistavat proteiinien translaation jälkeisen kypsymisen ja siten biologisen aktiivisuuden saavuttamisen. Tutkijat kääntyivät sitten eukaryoottisolujen malleihin . Vuonna 1982 syntyi ensimmäinen siirtogeeninen hiiri. Se tuottaa enemmän hormonia kuin normaalisti.
Vektori on tapa kuljettaa DNA: ta . Se on fragmentti, joka pystyy replikoitumaan itsenäisesti ja joka voi tukea toisen vaihtelevan kokoisen DNA-fragmentin (bakteeriplasmidi) insertiota.
Luovuttajaorganismi ilmentää kiinnostavaa proteiinia. Tätä proteiinia koodaava mRNA eristetään tästä organismista. MRNA mahdollistaa kloonauksessa käytettävän cDNA: n synteesin. Itse asiassa eukaryoottista genomista DNA: ta ei voida käyttää bakteerisysteemissä, koska bakteereilla ei ole mekanismia eukaryoottisten mRNA: iden liittämiseksi .
Siksi RT-PCR-tekniikkaa käytetään usein kiinnostavan geenin koodaavan cDNA: n saamiseksi. Sen jälkeen kun kokonais-mRNA: t on käänteiskopioitu ssDNA: ksi (yksijuosteinen) käyttämällä poly-dT-alukkeita, jotka ovat spesifisiä mRNA: iden poly-A-päille, kiinnostavaa proteiinia koodaavaa mRNA: ta vastaava cDNA monistetaan PCR: llä käyttämällä spesifisiä alukkeita, joihin lisätään restriktiokohtia. jota sitten käytetään kloonaukseen.
SäädösekvenssitKun kiinnostava cDNA on monistettu, on tarpeen lisätä siihen sekvenssit, jotka mahdollistavat transkriptiokudoksen kohdentamisen, sekä signaalit transkription ja translaation lopettamiseksi. Nämä sekvenssit ovat usein läsnä plasmidissa, jossa mielenkiinnon kohteena oleva geeni kloonataan:
Bakteereilla ei tarvita introneja .
PCR-monistettu cDNA kloonattiin vektoriin ( bakteerien keinotekoinen kromosomi , hiivan keinotekoinen kromosomi , bakteeriplasmidi jne.), Joka sisälsi yllä kuvatut säätelysekvenssit.
Tätä varten vektori (tässä plasmidi) sekä kiinnostuksen kohteena olevan geenin cDNA pilkotaan erilaisilla restriktioentsyymeillä cDNA: n insertoinnin suuntaamiseksi ennen plasmidissa olevan cDNA: n ligaatiota ligaasiin .
Rekombinanttiplasmidi viedään sitten bakteeriin transformaatiolla sen jälkeen puhdistettavan vektorin monistamiseksi. Ennen transgeneesin suorittamista vektori linearisoidaan ja bakteerien replikaatiosignaalit sekä plasmidissa olevat resistenssigeenit eliminoidaan käyttämällä restriktioentsyymejä.
Se on tekniikka, joka koostuu eksogeenisen geenin integroimisesta isäntäorganismin genomiin. Tämän manipulaation tarkoituksena on antaa isännän tuottaa kiinnostavaa proteiinia, jota ei ole tuotettu tietyllä lajilla, tai tuottaa sitä suuremmalla määrällä (käytetään tutkimustoiminnassa).
Se tehdään rekombinanttiproteiinin halutun käytön sekä funktionaalisen proteiinin tuottamiseksi tarvittavien solumekanismien mukaisesti:
Bakteereille ja hiivoille siirtogeeni joko viedään soluun plasmidilla tai integroidaan bakteerigenomiin kaksoishomologisella rekombinaatiolla.
Kasveissa rekombinantti-DNA: n integrointi tapahtuu "DNA-aseen" avulla, joka heijastaa DNA: lla päällystetyt kullan tai volframin mikrohelmet tai käyttämällä bakteereja, jotka kykenevät siirtämään DNA: ta isäntäsoluunsa (esim. Agrobacterium tumefaciens ).
Eläimille rekombinantti-DNA: n lineaarisessa muodossa olevan liuoksen injektointi suoritetaan munasolun urospuoliseen primaariin ennen karyogamiavaihetta . Injisoitu DNA integroidaan genomiin isäntäsolun DNA-korjausmekanismien avulla. Drosophila, seeprakala, sukkulamato, kana, ksenopus, hiiret ovat laajalti käytettyjä eläimiä.
Esimerkki transgeneesistä hiirimallissaEksogeeninen DNA injektoidaan urospuoliseen proklukleoon:
Tuotannon jälkeen proteiini puhdistetaan biokemiallisilla menetelmillä, kuten pylväskromatografia, korkean suorituskyvyn nestekromatografia jne.
On mahdollista, että integroidun siirtogeenin kopiomäärä on riittämätön mahdollistamaan kiinnostavan proteiinin tuotannon pitoisuutena, joka on tyydyttävä sen laajamittaiseen käyttöön.
Päinvastoin, siirretyn geenin ilmentyminen voi olla hiljaista. Itse asiassa, jos jälkimmäinen on integroitu heterokromatiinin alueen tasolle , geeniä ei transkriptoida eikä siten ekspressoida.
Siirtogeenin integroinnilla voi olla myös haitallisia vaikutuksia isäntäorganismin kehitykseen:
Antitrombiini III on proteiini, maksassa ja endoteelisolujen ihmisissä. Sen tehtävänä on estää verihyytymien muodostuminen laskimoissa ja valtimoissa. Antitrombiini III -tason lasku aiheuttaa tromboembolisen sairauden riskin . Antitrombiinin puutteet voivat johtua synnynnäisistä ongelmista tai ne voivat syntyä elämän aikana. Nykyään tieteen kehittyessä on mahdollista syntetisoida se geenitekniikan ansiosta.
Kuinka saada antitrombiini III geenitekniikalla ?Ensinnäkin meidän on valittava aktiivinen promoottori kudoksissa tai rauhasissa, joissa haluamme saada talteen rekombinanttiproteiinin (tässä vuohenmaito). Tämä promoottori on kloonattava. Jotta maitoa olisi proteiinia, lisätyn DNA-sekvenssin on koostuttava seuraavista:
Kun tämä vaihe on suoritettu, transgeneesi suoritetaan yllä kuvatulla tavalla. Lopuksi proteiini puhdistetaan ja markkinoidaan sitten (esimerkiksi nimellä ATryn).
Tämän tekniikan avulla on mahdollista saada paljon suurempia määriä antitrombiinia kuin ihmisen veressä.
Tätä ainetta voidaan antaa kahdella tavalla: