Toluidiini-DNA-sininen agar
Toluidiinisinistä DNA- agaria käytetään määrittämään nukleaasiaktiivisuuden esiintyminen mikro-organismissa.
Sitä käytetään rutiininomaisesti Staphylococcus aureus -lajille tyypillisen kuumuutta kestävän DNAse: n (tai termonukleaasi-TNaasin) ilmentymisen tunnistamiseen .
Käyttää
Tutkimusministeri lämpöä kestävästä DNAasia of Staphylococcus ( Food and Medical mikrobiologia )
Periaate
- Ensinnäkin lämpölabiilien nukleaasien poistaminen kuumentamalla (erityisesti Staphylococcus epidermidis ja Micrococcus sp. )
- Toluidiinisinisen metakromasia kohti punaista / vaaleanpunaista johtuu TNaasin vaikutuksesta väliaineen DNA: han (Ca ++ : n läsnä ollessa )
- Toluidiinisininen värjää nukleotidit vaaleanpunaiseksi.
Sävellys
N. Marchalin , JL Bourdonin ja Cl. Richardin Les Milieux de -kulttuuriin perustuva sävellys
- Tampon TRIS pH 9 (0,05 M) .................................1000mL - ADN .......................................................0,3g - Solution de bleu de toluidine (0,1 M)......................3mL - Solution de chlorure de calcium (CaCl2) (0,01 M) ..........1mL - chlorure de sodium (NaCl)..................................10g - Agar-agar..................................................10g( lopullinen pH = 8,6)
Valmistautuminen
Käyttövalmis väliaine. Se on mahdollista valmistaa perusainesosista.
Etsi termostabiilia DNA-ainetta tai termonukleaasia
Lämpöstabiili DNAasi on entsyymi, joka estopinnoitteet kuumentaa (100 ° C: ssa 15 minuutin ajan), ja joka hajoaa DNA seuraavan reaktion mukaisesti:
Tekninen
Inokuloi aivot-sydän-liemessä 24 tunnin ajan 37 ° C: ssa, tai 3-4 tunnin ajan, sekoittaen, jossa kanta on tutkittu.
Aseta osa siitä 15 minuutiksi vesihauteeseen (100 ° C) ja pidä loput.
Lävistä 3 reiän agar-levy. Siirrä muutama tippa:
- Steriili liemi ensimmäisessä kaivossa. (negatiivinen kontrolli)
- Liemi kuumennettiin ja jäähdytettiin toisessa kuopassa.
- Lämmittämätön liemi kolmannessa. (valinnainen - positiivinen kontrolli)
Inkuboi 4 tuntia 37 ° C: ssa.
Huomautuksia: Huomaa kunkin kuopan sisältö Petri-astian takaosassa. Rajoita muutamaan pisaraan liemi täyttämättä kaivoja. Inkuboi agaria kääntämättä astiaa.
Lukeminen
Mahdollisen metakromaasin vaaleanpunaisen halon havaitseminen osoittaa DNAse: n läsnäolon agarin siniselle taustalle porattujen reikien ympärillä.
- Kontrollihoito: sisältää steriiliä aivosydänlientä
- Kuopat, jotka sisältävät aivosydämen väliaineen tutkittavan kannan kanssa
- Hyvin sisältänyt aivosydämen väliaine kylvetty ja sitten kuumennettu 100 ° C: ssa 10 minuuttia
- Jos kaivo 1 muuttuu vaaleanpunaiseksi, testi on aloitettava uudelleen.
- Jos kuoppa 2 muuttuu vaaleanpunaiseksi ja kuoppa 3 pysyy sinisenä, kannassa on ei-termostabiili DNaasi.
- Jos kuopat 2 ja 3 ovat vaaleanpunaisia, kannassa on lämpöstabiili DNaasi (siis S. aureus, jos Hull- gram-positiivinen )
Rajat
- TNaasin läsnäolo S. hyicus , S. intermedius , S.lugdunensis ja S. schleiferi
Yksinkertaistettu vaihtoehto
Voidaan käyttää myös toista Diagnostics Pasteurin ehdottamaa menetelmää . Tästä se koostuu:
- On Baird-Paker , jälkeen 24 h viljelyn (tavallisesti 48 tuntia )
- Tarkkaile astioita epäilyttävien pesäkkeiden varalta (mustat pesäkkeet vaalealla halolla)
- Aseta nämä laatikot 60 ° C : seen 2 tunniksi ja anna jäähtyä
- Peitä Baird-Paker-elatusaine ylijäähdytetyllä DNA-tolueiiniväliaineella (~ 45 ° C ) ja anna jähmettyä.
- Inkuboidaan 37 ° C: ssa 3-4 tuntia
- Tarkkaile tulosta
Vaaleanpunaisen halon alueet ovat tässäkin ominaisia epäiltyjen pesäkkeiden bakteereissa läsnä olevalle termonukleaasille.
Katso myös
Viitteet
- N. Marchal, JL Bourdon, Cl. Richard , Les Milieux de culture: bakteerien eristämiseksi ja biokemialliseksi tunnistamiseksi , Doin,1987, s. 185; 192-193