Ensimmäinen on kuvattu vuonna 2009, Transcription aktivaattori-, kuten efektori- nukleaasi s (TALENS, transkription aktivaattori kaltainen efektori nukleaaseja ) ovat keinotekoisia restriktioentsyymeillä tuotettu fuusioimalla DNA: ta sitovan domeenin , jota kutsutaan TALE, jossa domeenin, jolla on kyky pilkkovat DNA .
Restriktioentsyymit ovat entsyymejä, jotka on kyky leikata DNA: spesifisen sekvenssin. Transkription aktivaattori kaltainen efektoreja (Tales, transkription aktivaattori kaltainen efektorit) voidaan nopeasti suunniteltu kiinnittymään käytännöllisesti katsoen minkä tahansa halutun DNA-sekvenssin. Yhdistämällä TALE-domeeni DNA: n pilkkomisdomeeniin (joka katkaisee DNA-juosteen) voidaan siten luoda spesifisiä restriktioentsyymejä mille tahansa DNA-sekvenssille. Kun nämä entsyymit viedään soluihin, niitä voidaan sitten käyttää genomin muokkaamiseen in situ .
TAL efektori (TALE) ovat proteiineja erittyy bakteerin Xanthomonas . DNA: ta sitova domeeni koostuu 33 tai 34 aminohapon toistosta, jotka ovat identtisiä lukuun ottamatta aminohappoja 12 ja 13. Nämä kaksi tähdettä ovat erittäin vaihtelevia ja osoittavat vahvaa korrelaatiota nukleotidispesifisen tunnistamisen kanssa . Tämä yksinkertainen suhde aminohapposekvenssin ja DNA: n tunnistamisen välillä mahdollistaa sekvenssispesifisten DNA: ta sitovien domeenien luomisen valitsemalla toistuvien segmenttien kokoonpano, joka sisältää sopivat vaihtelevat tähteet.
Epäspesifinen DNA: n katkaisun domeenin Fok1 endonukleaasi voidaan rakentaa hybridi nukleaasien , joiden on osoitettu olevan tehokkaita hiivassa määrityksissä. Nämä proteiinit ovat aktiivisia myös kasvi- ja eläinsoluissa. Ensimmäiset TALEN-tutkimukset tehtiin Fok1: n alkuperäisellä domeenilla, mutta uudemmissa lähestymistavoissa käytetään domeeneja, joissa on mutaatioita, jotka on erityisesti suunniteltu lisäämään DNA: n pilkkoutumisen spesifisyyttä ja tehokkuutta. Fok1-domeenit toimivat dimeerinä , joka vaatii kaksi konstruktiota, joissa on DNA: ta sitovia domeeneja, jotka on suunnattu genomissa olevia kohtia vastaan päähän-hännän suuntaan ja oikealla etäisyydellä. TALE-domeenin ja Fok1-domeenin välinen aminohappojen määrä sekä emästen lukumäärä genomissa olevien kahden sitoutumiskohdan välillä ovat kaksi tärkeää parametria kimeerisen entsyymin hyvän aktiivisuuden varmistamiseksi.
Aminohapposekvenssin ja DNA: ta sitovan domeenin tunnistaman DNA-sekvenssin välinen yksinkertainen suhde mahdollistaa henkilökohtaisten proteiinien synteesin. TALENien tapauksessa entsyymiä koodaavan geenin keinotekoinen synteesi on ongelmallista, koska DNA: n sitoutumisdomeenin toistuvat sekvenssit uhkaavat hybridisoitua keskenään oligonukleotidien synteesivaiheiden aikana . Yksi ratkaisu tämän ongelman voittamiseksi on käyttää yleisölle avoimia ohjelmistoja ( DNAWorks ) sopivien oligonukleotidien määrittämiseksi kokoonpanoa varten kahdella PCR- vaiheella, jota seuraa koko geenin monistus. On myös suunniteltu useita muita menettelyjä TALE-verkkotunnusten kokoamiseksi.
Kun geenit koodaa TALENS on koottu, ne lisätään plasmidit . Sitten plasmideja käytetään transfektoimaan halutut solut, joissa TALEN-proteiini ekspressoituu ja kulkeutuu ytimeen päästäkseen genomiin. TALENeja voidaan myös viedä soluun mRNA : n muodossa, mikä eliminoi TALENia koodaavan geenin mahdollisuuden integroida genomiin.
TALEN-molekyylejä voidaan käyttää genomin modifikaatioihin niiden kyvyllä indusoida DNA: n kaksoisjuosteiset katkokset (DSB), joihin solut reagoivat DNA: n korjausmekanismien kautta . Ei-homologinen end- joining (NHEJ) -korjaus antaa mahdollisuuden yhdistää kaksi kaksisäikeisestä katkoksesta johtuvaa DNA-päätä uudelleen, kun täydentävää sekvenssiä ei ole käytettävissä. Tämä korjausmekanismi aiheuttaa virheitä genomissa insertioiden ja / tai deleetioiden kautta; samoin kuin kromosomien uudelleenjärjestelyt. Kaikki nämä virheet tekevät todennäköisesti tässä lokuksessa koodatun geenituotteen toimimattomaksi. Koska entsyymin aktiivisuus voi vaihdella käytetyn lajin, solutyypin, kohdegeenin ja nukleaasin mukaan, nämä parametrit on otettava huomioon suunniteltaessa TALENia ja mutaatioiden syntyminen on otettava huomioon. Yksinkertainen heteroduplex-pilkkomiskokeilu voi havaita eroja kahden PCR: llä monistetun alleelin välillä. Katkaisutuotteet voidaan visualisoida agaroosigeelillä . Vaihtoehtoisesti DNA voidaan viedä genomiin hyödyntämällä NHEJ: tä huolehtimalla eksogeenisen DNA-lähteen aikaansaamisesta .
Homologinen rekombinaatio voi myös sallia vieraan DNA: n viemisen rikkoutumiskohtaan, jolloin transfektoitua kaksijuosteista DNA: ta voidaan käyttää korjausentsyymien avulla templaattina.
TALEN-soluja on käytetty ihmisen alkion kantasolujen ja geneettisesti muunnettujen iPS- solujen tuottamiseen, mutta myös tuottamaan tyrmäyksiä erilaisiin organismeihin, kuten C. elegans , rotat, hiiret tai jopa seeprakala . On myös osoitettu, että kahden TALEN-parin käyttö mahdollistaa kahden geenin samanaikaisen muokkaamisen samanaikaisesti. Äskettäin tätä tekniikkaa voidaan käyttää myös koputusten luomiseen . Siten TALEN: it injektoitiin rotan munasoluihin, mikä mahdollisti koputtavien rottien tuottamisen glukokortikoidireseptorille.
Jos TALEN ei ole tarpeeksi spesifinen kohdekohtaansa tai se ei kohdista ainutlaatuista sekvenssiä kiinnostavassa genomissa, voi tapahtua ei-toivottuja katkaisuja. Tällainen esine voi aiheuttaa tarpeeksi kaksisäikeisiä taukoja hukuttaa DNA: n korjauskoneiston , mikä voi johtaa kromosomien uudelleenjärjestelyihin tai jopa solukuolemaan . Nämä epäspesifiset pilkkomiset voivat tapahtua myös muiden keinotekoisten nukleaasien, kuten sinkkisormenukleaasien , kanssa, joiden epäspesifinen vaikutus on paremmin karakterisoitu.