Polymeraasiketjureaktio ( PCR ) tai polymeraasiketjureaktio , yleensä sigle PCR (alkaen Englanti : polymeraasiketjureaktio ) tai nukleiinihapon monistamiseen testaus (NAT ranskalainen Kanada) on menetelmä, biologia molekyyli- geenin monistuminen in vitro .
Sen avulla on mahdollista kopioida tunnetusta DNA- tai RNA- sekvenssistä suuria määriä (miljardin suuruisen kertoluvun kertoimella) pienestä määrästä (muutaman pikogramman luokkaa) happoa nukleotidia ( spesifinen DNA- sekvenssi ( ( amplikoni )) ja spesifiset alukkeet, jotka koostuvat 25 - 25 nukleotidin synteettisistä oligonukleotideista. Voimme siis esimerkiksi havaitsemaan HIV tai mitata viruskuorma (pitoisuus viruksen plasmassa), jälkiä GMO: (geneettisesti muunnettuja organismeja), tai B-hepatiitti, C ja D viruksia.
Yhä käytetään tutkintaan , tämä tekniikka perustuu kahden tekijän yhdistelmään:
Nämä elementit mahdollistavat entsymaattisen aktiivisuuden säätelyn syklisesti toistettujen lämpötilasiirtymien ( lämpösyklin tarjoamien ) ansiosta (vrt. Ketjureaktio ).
Ensimmäiset käytetyt DNA-polymeraasit tulivat termofiilisestä bakteerista (kestää hyvin korkeita lämpötiloja), esimerkiksi Thermus aquaticus ( Taq-polymeraasi ) tai jopa Pyrococcus furiosus (Pfu-polymeraasi), Thermococcus litoralis (Vent tai Tli-polymeraasi), Thermus thermophilus (Tth-polymeraasi) . Nykyään käytettyjen entsyymien sanotaan olevan rekombinantteja , mikä yksinkertaistaa huomattavasti niiden tuotantoa, ja niiden ominaisuuksia on muunnettu laajasti, jotta niistä tulisi tehokkaampia ja uskollisempia.
Alle kymmenessä vuodessa olemme oppineet tekemään yli miljardi kopiota alle tunnissa, mikä aiheutti PCR: n laboratorioissa mullistamalla molekyylibiologian. Se on kuitenkin epäluotettava joillekin näytelähteille ( virtsa , yskökset ), johtuen mahdollisesti Taq-polymeraasin estäjistä .
PCR on tekniikka, joka on mullistanut molekyylibiologian ja vakiinnuttanut asemansa laboratorioissa. Sitä vastoin reaaliaikaisen PCR: n jouduttiin odottamaan useiden teknisten innovaatioiden tuloa markkinoille ennen niiden kehittämistä, ja sitä pidetään edelleen uutena menetelmänä. Avainsanoille " polymeraasiketjureaktio " (1) ja " reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio " (2) vastaavien artikkelien määrä vuodessa PubMed- hakukoneessa antaa melko hyvän kuvan niiden merkityksestä tieteellisessä maailmassa. Huomaa, että menetelmä ei ole vapaa puolueellisuudesta, esimerkiksi joitain artikkeleita löytyy reaaliaikaisesta PCR: stä vuosina 1991 ja 1992 (katkoviiva), kun taas sen periaatetta kuvattiin vasta vuonna 1993. Ero (1 -2) edustaa painoa ja päätepisteen PCR , joka todennäköisesti vähitellen väistyä reaaliajassa.
Tämä tekniikka on kehittynyt suuresti alusta lähtien. Tärkeimpien muutosten joukossa on:
Selkeyden vuoksi päivämäärät vastaavat kentän ensimmäistä julkaisua ja vain ensimmäiset kirjoittajat mainitaan, täydelliset viitteet ovat luvussa ”Bibliografia”. Tämä valinta mahdollistaa myös sellaisten kiistojen rajoittamisen, kuten Rosalind Elsie Franklinin roolin DNA-kaksoiskierteen rakenteen löytämisessä.
PCR on tekniikka, joka perustuu lämpötilanmuutosjaksojen toistoon. Tiettyjä menetelmiä (esim. Hydrolyysikoettimien käyttöä) lukuun ottamatta jokainen sykli sisältää kolme alla kuvattua vaihetta. Didaktisuuden vuoksi tarkastelemme seuraavaa esimerkkiä 100%: n PCR-hyötysuhteella.
Tämä vaihe tehdään yleensä huoneenlämmössä. Kaksoisjuosteinen DNA omaksuu kaksoiskierteen konformaationsa. Tässä esimerkissä katsotaan, että liuoksessa on vain yksi alkuperäinen kaksijuosteinen DNA-molekyyli, värillinen alue (vaaleanpunainen ja oranssi), joka vastaa amplikoniamme. Huomautus: Käänteiskopioinnista johtuvat komplementaariset DNA: t ovat yleensä yksijuosteisia ja ottavat sitten käyttöön kompleksiset kolmiulotteiset konformaatiot, jotka ovat samanlaisia kuin RNA: t.
Alkuperäinen denaturaatio (1 'kaaviossa)Ennen varsinaisen PCR-sykliä, kuumennusvaihe (yleensä 10 kohteeseen 15 minuutin ajan 95 ° C: ssa ) suoritetaan. Tämä vaihe antaa mahdollisuuden: dehybridisoida kaksijuosteiset DNA: t, rikkoa sekundäärirakenteet, homogenoida reaktioväliaine lämpösekoittamalla, aktivoida "Hot start" -tyyppiset polymeraasit, denaturoida muita entsyymejä, jotka voivat olla liuoksessa ( Käänteiskopioija, urasiili-N-glykosylaasi).
Denaturointivaihe (1 kaaviossa)Tämä vaihe (yleensä 0 - 1 minuutti 95 ° C: ssa ) mahdollistaa DNA: n dehybridisoinnin, matriisiin silti sitoutuvien polymeraasien "irrottamisen" ja reaktioväliaineen homogenisoinnin.
Alukkeiden hybridisaatio- tai paritusvaihe (2 kaaviossa)Tämä vaihe (yleensä 2 ja 60 sekunnin ajan 56 - 64 ° C ) avulla sense- ja antisense-alukkeina hybridisoitua templaattiin DNA: iden ansiosta lämpötilaan, joka on termodynaamisesti edullisempi. Harvat templaatti-DNA-juosteet voivat hybridisoitua (sitoutua) komplementaarisen juosteensa kanssa, mikä estäisi alukkeen sitoutumisen, koska alukkeet ovat paljon lyhyempiä ja paljon suuremmina pitoisuuksina. Kokeellisesti havaitaan, että PCR toimii myös hybridisaatiovaiheen kanssa, jonka lämpötila on muutama astetta korkeampi kuin alukkeiden teoreettinen Tm, luultavasti siksi, että ne ovat jo vuorovaikutuksessa polymeraasien kanssa, mikä vakauttaisi niiden hybridisaation templaatti-DNA: han.
Alukkeiden ominaisuudetTämä vaihe (yleensä 4 ja 120 sekunnin ajan 72 ° C: ssa ) mahdollistaa polymeraaseja syntetisoida komplementaarinen juoste niiden templaatti-DNA: n lämpötilassa, joka on optimaalinen niitä. Tämä juoste on valmistettu reaktioväliaineessa olevista vapaista dNTP: istä . Tämän vaiheen kesto riippuu normaalisti amplikonin pituudesta.
Vaiheen 3 lopussa meillä on sitten kaksi malli- DNA-juosetta ja kaksi DNA-juosetta (yksi sense- ja yksi antisense-DNA), jotka on määritelty tarkasti vain niiden 5'-päässä.
Työkierto n o 2Kolme faasia etenevät samalla tavalla kuin syklissä n o 1, paitsi että kaksi polymeraasia, jotka ovat saavuttaneet templaatti-DNA: nsa, irtoavat itsestään. Vaiheen 3 lopussa saadaan kaikki PCR: n aikana esiintyvät DNA-tyypit, nimittäin:
Sama syklille 2. Vaiheen 3 lopussa havaitaan yksi tyypin A ja F ketju, B: n ja D: n 3 ja C: n ja E: n 4 säde. Havaitaan kahden CE-kaksisäikeisen DNA-molekyylin ulkonäkö. amplikoniin.
Työkierto n o 4Sama syklille 3. Vaiheen 4 lopussa havaitaan yksi tyypin A ja F säikeet, B: n ja D: n 4 ja C: n ja E: n 11. Havaitaan, että amplikonista tulee enemmistöyhdistelmä.
Cycles n o 5 ja sen jälkeenJos olisimme lisänneet syklien määrää, olisimme saaneet seuraavan taulukon:
syklit | ||||||||||||||||||
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ei | ||
molekyylityyppi | TO | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
B | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
VS | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
D. | 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | 15 | ||
E | 0 | 0 | 1 | 4 | 11 | 26 | 57 | 120 | 247 | 502 | 1013 | 2036 | 4083 | 8178 | 16369 | 32752 | ||
F | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
yksisäikeinen | määrä | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | 65536 | A n - F n |
% amplikonista | 0,00 | 0,00 | 25.00 | 50,00 | 68,75 | 81,25 | 89.06 | 93,75 | 96,48 | 98.05 | 98,93 | 99,41 | 99,68 | 99,83 | 99,91 | 99,95 | ||
kaksoisnauha | määrä | 1 | 2 | 4 | 8 | 16 | 32 | 64 | 128 | 256 | 512 | 1024 | 2048 | 4096 | 8192 | 16384 | 32768 | |
% amplikonista | 0,00 | 0,00 | 0,00 | 12.50 | 43,75 | 65,63 | 79,69 | 88,28 | 93,36 | 96,29 | 97,95 | 98,88 | 99,39 | 99,67 | 99,82 | 99,91 |
jossa A n (B n , jne.) on määrä molekyylejä tyyppiä A (B, jne.) jälkeen läsnä n : nnen syklin.
Analysoimalla tätä taulukkoa havaitsemme, että:
Nämä arvot saatiin yhdestä kaksijuosteisen DNA: n alkumolekyylistä alkaen, mutta muuten jokainen templaatti olisi käynyt läpi saman prosessin. Tietyssä syklissä DNA: n määrä riippuu matriisien alkuperäisestä lukumäärästä. Toisaalta, riippumatta sen alkupitoisuudesta, on teoriassa mahdollista saada mikä tahansa määrä säätämällä syklien lukumäärää. Siksi PCR: ää säännellään teoreettisesti lailla:
Mutta PCR on monimutkainen entsymaattinen reaktio. Tuote on identtinen substraatin kanssa ja voi estää entsyymiä, mutta ennen kaikkea toissijaiset reagenssit (alukkeet, dNTP) voivat alkaa puuttua. PCR: llä voi siis olla eksponentiaalinen monistumislainsäädäntö vain, kunhan templaatti-DNA on ainoa rajoittava tekijä . Reaktiosta tulee sitten arvaamaton, ja sitten on mahdotonta pystyä vertaamaan useita näytteitä keskenään ilman enemmän tai vähemmän merkittävää kvantitatiivista puolueellisuutta (katso kvantitatiivista PCR: ää käsittelevä artikkeli ). Siksi on tärkeää ymmärtää PCR-kinetiikan eri vaiheet.
Tämä luku käsittelee PCR: n mitattavaa kinetiikkaa, koska tekniset rajoitukset tekevät pääsemättömiksi alkuvaiheet ja yleensä suuren osan eksponentiaaliosasta. Sen näennäinen (mitattava) profiili omaksuu useita erillisiä vaiheita, enemmän tai vähemmän kehittyneitä metodologisten valintojen mukaan.
Huom : Termillä tehokkuus voi olla kaksi merkitystä kirjoittajien mukaan:
Näistä kahdesta käsitteestä tehdyt johtopäätökset (jotka voidaan johtaa suoraan toisistaan) ovat täysin samat; seuraavaa keskustelua varten säilytetään ensimmäinen määritelmä, enemmistö. Tämä PCR-tehokkuus on perustekijä, joka on otettava huomioon kvantitatiivisen mittauksen saamisessa tai multipleksisen PCR-protokollan muodostamisessa, mutta se on yleensä merkityksetön kvalitatiivisen tai loppupisteen PCR-tuloksen suhteen .
Täydellisen teoreettisen syklin tapauksessa kukin templaattijuoste antaa yhden ja vain yhden täydellisen kopion amplikonista. Säikeiden kokonaismäärä kaksinkertaistuu siis jokaisessa vaiheessa, ja PCR-reaktion (merkitty E ) teoreettinen tehokkuus on tässä tapauksessa täsmälleen yhtä suuri kuin kaksi. Kaaviossa, joka antaa tuloksen puolilogaritmisessa vertailuarvossa , tämä johtaa siihen, että suoraviivan osan kaltevuus vastaa log (2): n ihanteellista etenemistä jaksoa kohden (ts. Noin 3 desibeliä / jakso).
Reaaliaikaisen PCR: n tulo korosti, että todellinen reaktiotehokkuus ei aina ollut yhtä kuin kaksi. Tämä tarkoittaa, että kaikkien jaksojen pitää kvantitatiivinen (alue n o 6 kinetiikka) on todellisia olosuhteita replikaation, säikeen ei voi antaa kopion ja yhden. Puolilogaritmisessa vertailukaaviossa tämä johtaa oikean puolen kaltevuuteen, joka eroaa odotetusta kaltevuudesta ja on yleensä vähemmän jyrkkä. Kokeellinen kaltevuus on mitattavissa ja antaa E: n kokeellisen arvon . Se, että tämä osa on suora, tarkoittaa, että tällä pitoisuusvälillä säikeiden tuottamien kopioiden keskimääräinen lukumäärä on vakio syklistä toiseen (ja erityisesti ei riipu pitoisuuksista). Mutta tässä tapauksessa ei ole "yksi kappale ja vain yksi kutakin säiettä kohti", vaan eri numero.
Suurin osa kokeellisista protokollista antaa PCR-hyötysuhteen välillä 1,75 - 2. Kaksi ilmiötä ovat tärkeimmät syyt ja johtavat kokeiden hyötysuhteeseen, joka on pienempi tai yhtä suuri kuin kaksi, koska biokemialliset reaktiot eivät ole aina täydellisiä, jotkut replikaatiot epäonnistuvat todellisissa kokeellisissa kokeissa. olosuhteet:
Päinvastoin, jotkut lähteet katsovat, että ne voivat olla myös suurempia kuin kaksi (mikä olettaa, että juosteella on huomattava todennäköisyys suorittaa kaksi tai useampia synteesejä syklin aikana), ja se olisi hyväksyttävä arvoon 2.3 saakka. Se voidaan selittää kahdella tavalla:
Sitten kaksi koulua ovat ristiriidassa toisten kokeellisten argumenttien kanssa. Yksi katsoo, että tämä tehokkuus on vakio kullekin amplikonille tietyssä kokeellisessa protokollassa. Toinen katsoo, että se vaihtelee aina merkittävästi ja että se on jatkuvasti mitattava uudelleen. On huomattava, että on hyvin vaikeaa tietää, johtuuko havaitun PCR-tehokkuuden vaihtelu tämän menetelmän luonteesta, vaihtelusta kokeellisessa protokollassa (reagenssien toistettavuuden tai käsittelyn puute) vai vaihtelusta tiedoissa hankinta (fluoresenssin vaihtelut, erilaiset lukukanavat, ennakkoluulot matemaattisessa analyysissä). On myös erittäin vaikeaa olla varma, että käytetty tehokkuus (mitattuna kussakin kokeessa tai ei) on todellakin se, joka tapahtui kalibroitavassa näytteessä (katso kvantitatiivinen PCR ).
Lyhenteet ja nimet englanniksi ovat suluissa.
Multipleksinen PCR ( multiplex PCR ) on protokolla useamman kuin yhden amplikonin vahvistamiseksi kerrallaan käyttämällä vähintään kolmea aluke-PCR-reaktiota. Tällöin PCR-tuotteet ovat kilpailukykyisiä vain polymeraasin, dNTP: iden ja mahdollisesti DNA-markkerin suhteen. On myös mahdollista monistaa saman tyyppisten alukkeiden tunnistamat erityyppiset DNA: t, kuten jäljitelmät. Multipleksinen PCR voidaan tehdä loppupisteessä (PCR-tuotteet erotetaan yleensä niiden koon tai restriktiokohdan läsnäolon perusteella) tai reaaliajassa (kukin tuote mitataan tietyllä koettimella kytkettynä fluoroforiin, jonka spektripäästöt poikkeavat muut). Sen laadullisia sovelluksia on useita (viruskannan, mutaatioiden jne. Havaitseminen), mutta kvantitatiivinen näkökulma ei ole yksimielinen huolimatta voimakkaasta teollisesta painostuksesta näille erittäin tuottoisille markkinoille.
Meta-PCR on menetelmä, jonka avulla voidaan antaa synteettinen DNA-molekyyli, joka käsittää minkä tahansa PCR: llä amplifioitavan DNA: n yhdistelmän missä tahansa järjestyksessä. Se suoritetaan yhdessä putkessa ja se koostuu kahdesta eri PCR-vaiheesta, jotka erotetaan sulatusjaksolla jäännöspolymeraasiaktiivisuuden poistamiseksi. Meta-PCR: ää voidaan käyttää mutaatio- ja skannausmenetelmien läpimenon lisäämiseen.
Nested-PCR , PCR-veto tai nested-PCR: llä ( nested-PCR ) on PCR kahdessa peräkkäisessä vaiheessa, jossa on kaksi eri alukepareja, toinen sitova, jotka sijaitsevat ensimmäisen amplikonin. Tätä tekniikkaa käytettiin alun perin vähentämään kontaminaatioriskiä (lopputuotteen oli kyettävä vuorovaikutukseen kahden alukeparin kanssa, joten kaksi spesifisyystasoa). RNA-virusten parissa työskentelevät virologit käyttävät sitä nyt laajalti, joilla voi olla suuri mutatoituvuus. Ensimmäinen alukepari on suunniteltu siten, että se pystyy kiinnittämään viruksen genomin muutamat vakaat osat, toinen tunnistamaan alatyypin. Se mahdollistaa myös paremman tuloksen herkkyyden.
Se on PCR-monistus pienen määrän yhden alukkeen läsnä ollessa. Se sallii monistettujen fragmenttien suoran sekvensoinnin. Ensimmäisten 20-25 syklin aikana syntyy kaksijuosteista DNA: ta, kunnes rajoittava aluke on loppuun käytetty, ja yksijuosteista DNA: ta tuotetaan viimeisten 5-10 syklin aikana. Käytettyjen alukkeiden suhteet ovat 50 pmol / 1 - 5 pmoolia / 100 ui (1 - 3 pmolia yksijuosteista 30 syklin jälkeen).
Lämpöasymmetrinen lomitettu PCR ( TAIL-PCR tai Thermal asymmetric lomitettu PCR ) on monimutkainen protokolla, joka yhdistää sisäkkäisen PCR: n, alukkeiden Tm: n epäsymmetrisen PCR: n periaatteet, useiden syklityyppien peräkkäin, joka suosii tällaisen alukkeen hybridisaatiota ja rappeutuneet alukkeet. Tavoitteena on saada lopullinen amplikoni, joka on spesifinen DNA-sekvenssille, jonka vain yksi pää tunnetaan yleisesti tuntemattoman osan sekvensoimiseksi. Tätä menetelmää käytetään laajasti kromosomikävelyyn tai immunoglobuliinien vaihtelevien sekvenssien karakterisointiin.
Tämä on tekniikka, joka auttaa uuden PCR-protokollan kehittämisessä. Se vaatii lämpösyklilaitteita, jotka pystyvät varmistamaan erilaiset lämpötilat samalle vaiheelle eri näytteille. Sitä käytetään pääasiassa hybridisaatiovaiheen optimointiin, erityisesti multipleksoidussa PCR: ssä.
Semi-kvantitatiivinen PCR perustuu keskeytyminen PCR useissa jaksoissa, jotka vastaavat liikkumattoman faasin (DNA: n määrä kasvaa hyvin hitaasti, koska on vähän templaatti-DNA), eksponentiaalinen vaihe (nopea kasvu) ja tasanteen (vähennys reagenssien määrässä). Näytettä varten on mahdollista arvioida DNA: n alkuperäinen määrä, jos on näytettä, jossa DNA: n määrä tunnetaan (standardi). Niiden PCR-monistus, pysähtymisen välisen reaktion 20 : nnen ja 30 : nnen PCR-syklin ja vertaamalla valointensiteettien PCR-tuotteiden merkitty BET mahdollista arvioida alkuperäisestä määrästä DNA. Kahden näytteen osalta on mahdollista verrata niiden alkuperäistä DNA-määrää pysäyttämällä PCR ennen PCR-tasoa (<30 sykliä).
Reaaliaikainen PCR tai kvantitatiivinen PCRReaaliaikainen PCR ( Real-time PCR ) on vallankumous käyttäen PCR: ää, tätä tekniikkaa koostuu mitataan polymeroitu DNA: n määrä kussakin syklissä (real time), jossa on fluoresoiva leima . Se sallii periaatteellaan tehdä kvantitatiivisia mittauksia (selittää nimen kvantitatiivinen PCR, qPCR ), mutta se vaatii erityisiä lämpösyklereitä . Sitä ei pidä sekoittaa RT-PCR: ään ( Reverse Transcription PCR ), joten suosimme nimiä kvantitatiivinen PCR tai qPCR . Tietyt kokeet kilpailevassa PCR: ssä tai radioaktiivisessa PCR: ssä mahdollistavat hyödynnettävien kvantitatiivisten mittausten saamisen.
Päätepiste PCRPCR loppupiste ( end-kohta PCR ) on termi, joka syntyi vastustaa reaaliaikaisella PCR: llä . Se viittaa kaikkiin määritysyrityksiin PCR-reaktion lopputuotteesta.
Kosketuskohta Polymeraasiketjureaktio ( Touchdown-PCR ) on protokolla, jota käytetään DNA: n monistamiseen huonosti edustettuna ja / tai käynnissä kilpailua niiden alukkeiden pseudo-geenin tuotteita. Se koostuu siitä, että hybridisaatiolämpötila on erittäin korkea ensimmäisten syklien aikana korkean tiukkuuden ja siten spesifisen monistuksen varmistamiseksi. Kun kiinnostavasta sekvenssistä tulee enemmistö kilpailijoihin nähden, hybridisaatiolämpötilaa alennetaan asteittain paremman PCR-tehokkuuden varmistamiseksi. Tehokkuus ei ole vakio koko reaktion ajan, tähän mennessä ei ole mahdollista saada kvantitatiivista tulosta ilman puolueellisuutta.
Pesäkkeen PCR ( Colony PCR ) on menetelmä yksinkertaisen mikro-organismi-DNA: n (bakteerien, arkeoiden tai hiivojen) monistamiseksi siirtämällä pesäkettä suoraan PCR: n reaktioseokseen. Denaturoitumisen ensimmäisten vaiheiden aikana solut hajotetaan ja niiden DNA vapautuu reaktioväliaineeseen. Näin vapautunut DNA voi sitten toimia mallina.
Colony PCR: ää käytetään erityisesti transgeneesin tehokkuuden tarkistamiseen. Sitä käytettiin laajalti BAC : iden rakentamisen aikana suurissa sekvensointiohjelmissa .
Colony PCR: ää käytetään laajalti mikrobiologisessa tutkimuksessa tutkittavien kantojen fylogeneettisen karakterisoimiseksi.
Ep-PCR sallii virheiden lisäämisen sekvenssiin, jonka polymeraasi kopioi. Tätä tekniikkaa voidaan käyttää esimerkiksi suuren määrän mutanttien luomiseen, jotka sitten valitaan (suunnattu evoluutio). Käytetyllä polymeraasilla (Taq-polymeraasi on luonnollisesti pienempi uskollinen kuin tavanomainen polymeraasit PCR) ja erityiset edellytykset (suurina pitoisuuksina MgCI 2 tai lisäämällä MnCI 2 ) avulla on mahdollista lisätä määrä virheitä.
RT-PCR ( käänteiskopiointi-polymeraasiketjureaktio ) on tekniikka, joka yhdistää käänteiskopioinnin (RT), jota seuraa PCR. Se syntetisoi RNA: n komplementaarisen juosteen deoksiribonukleotidien kanssa käyttämällä RNA: sta riippuvaa DNA-polymeraasia ( käänteistranskriptaasi ). Tämä cDNA on yleensä tarkoitus monistaa PCR: llä (cDNA on vakaampi, se antaa enemmän vapautta kuin RNA: t seuraavia analyysejä varten).
Hyödyllisyys: sitä käytetään kliiniseen diagnoosiin kvantitatiivisten mittausten avulla reaaliaikaisella PCR: llä (viruskuormien tutkimus RNA-viruksilla) ja kvalitatiivisilla mittauksilla (geeniekspressiotuotteen analyysi). Se voi myös helpottaa suurten geenien sekvensointia .
Käänteiskopiointi on edelleen herkkä (heikko toistettavuus; RNA: n haavoittuvuus, usein DNA: n aiheuttama kontaminaatio. Spesifinen monistus on joskus tarpeen (jos elatusaine sisältää homologisia sekvenssejä paljon suurempia määriä kuin mielenkiinnon kohteena oleva sekvenssi). PCR-alukkeiden ja sisäisten tai ulkoisten standardien noudattaminen on usein erittäin tärkeää.
Yhden vaiheen RT-PCRRT-PCR-vaihe a ( yksivaiheinen RT-PCR ) on protokolla, joka sekoittaa reagoivat aineet RT ja PCR niin, että molemmat vaiheet voidaan suorittaa ilman, että putkea on avattava. Tämä mahdollistaa kontaminaation tai näytteen kääntämisen riskin pienentämisen, mutta reaktioväliainetta on vaikeampi optimoida kutakin vaihetta varten. Tämä aiheuttaa edelleen ennakkoluulojen riskin RT-vaiheen normalisoimiseksi, koska siihen liittyy multipleksisen PCR: n käyttö.
RT-PCR in situRT-PCR in situ on menetelmä, joka koostuu RT-PCR: n suorittamisesta ei liuoksessa olevilla molekyyleillä vaan histologisilla leikkeillä. Vaikka tulokset ovat vain puolikvantitatiivisia, ne tarjoavat myös tietoa transkriptien sijainnista kudoksessa.
Kvantitatiivinen RT-PCRKvantitatiivista RT-PCR: llä (qRT-PCR) on tekniikka voidaan arvioida määrällisesti tyypin RNA alun perin läsnä näytteessä. Tämä termi tarkoittaa kahden tekniikan käyttöä peräkkäin, käänteiskopiointia, jota seuraa reaaliaikainen PCR. Useimpien biologien päätavoite herättää vilkkaita kiistoja ulkoisen tai sisäisen kalibraattorin (kotitalousgeeni) käytöstä. Kilpailevia homologisia ulkoisia kalibraattoreita käyttäviä monimutkaisia protokollia lukuun ottamatta se sallii vain suhteellisen kvantifioinnin.
RT-PCR solussaYksisoluinen RT-PCR ( yksisoluinen RT-PCR ) on menetelmä, jota käytetään yksittäisen solun transkriptioiden tutkimiseen, jotka on saatu patch-clampilla, lasermikrodissektiolla tai solujen lajittelulla fluoresenssiaktiivisuuden mukaan (FACS englanniksi fluoresenssiaktivoidulla solujen lajittelulla ). Tämä tarkkuus voi olla tarpeen, kun kudos ei ole homogeeninen (kasvainsolut, hyvin erilaistuneet solukerrokset jne.), Mutta kvantifiointi tulee epätarkemmaksi stokastisten vaikutusten monistumisen vuoksi ja vaatii siksi mittausten moninkertaistamista.
Toinen isoterminen monistustekniikka: "nukleiinihappojen polymerointi kontrolloitua apoptoosia varten". Kirjoittajat väittävät, että tämä tekniikka voitaisiin toteuttaa elävissä soluissa ja siten hoitaa erilaisia patologioita (HIV, malaria, syövät jne.), Mutta mikään muu ryhmä ei ole tällä hetkellä vahvistanut näitä väitteitä.
TP-PCR (TP tarkoittaa Triplet Repeat primed ), kompleksinen PCR-muunnos, kehitti Jon Warner vuonna 1996, ja sitä käytetään toistuvien triplettien geenien monistuksissa, kuten Steinertin myotonisen dystrofian tapauksessa . PCR- sekvensointikombinaatiota ei voida käyttää näissä tapauksissa, koska Taq-polymeraasi tekee replikaatiovirheitä.
Helikaasi-riippuvaisesta amplifikaatiosta ( helikaasi-riippuvaisesta amplifikaatiosta , HDA ) on uusi tekniikka lähellä-PCR, jossa lämpötila-indusoidun dehybridization on aikaansaatu helikaasi.
PCR mahdollistaa bakteerien tai virusten aiheuttamien tartuntatautien nopean ja erittäin spesifisen diagnoosin. PCR mahdollistaa myös ei-viljeltävien tai hitaasti kasvavien mikro-organismien, kuten mykobakteerien , anaerobisten bakteerien tai virusten , tunnistamisen kudosviljelymäärityksistä ja eläinmalleista. PCR-diagnostisten sovellusten perusta mikrobiologiassa on tartuntatautien havaitseminen ja ei-patogeenisten kantojen erottaminen patogeenisistä kannoista spesifisten geenien perusteella.
Tarttuvien organismien karakterisointi ja havaitseminen on mullistettu PCR: llä seuraavasti:
Ihmisen immuunikatovirus (tai HIV ) on vaikea löytää ja hävittää kohde. Ensimmäiset infektiotestit perustuivat viruksen vasta-aineiden esiintymiseen verenkierrossa. Vasta-aineet ilmestyvät kuitenkin vasta useita viikkoja infektion jälkeen, äidin vasta-aineet peittävät vastasyntyneen infektion, ja infektiota torjuvat terapeuttiset aineet eivät vaikuta vasta-aineisiin. PCR-testit on kehitetty kykenemään havaitsemaan yhden virusgenomin suuruiset pienet viruskuormat yli 50000 isäntäsolun DNA: ssa. Infektiot voidaan havaita aikaisemmin, luovutettu veri voidaan seuloa suoraan viruksen varalta, vastasyntyneet voidaan testata välittömästi infektion varalta ja viruslääkkeiden vaikutukset voidaan mitata.
Joitakin patogeenisiä organismeja, kuten tuberkuloosia , on vaikea kerätä potilailta, ja ne kehittyvät hitaasti laboratoriossa. PCR-pohjaiset testit voivat havaita pienen määrän patogeenisiä organismeja (eläviä tai kuolleita) näytteistä. Yksityiskohtaista geneettistä analyysiä voidaan käyttää myös antibioottiresistenssin havaitsemiseen, mikä mahdollistaa välittömän ja tehokkaan hoidon. Antibioottihoidon vaikutukset voidaan myös arvioida välittömästi.
Patogeenisen organismin leviämistä kotieläinten tai villieläinten populaatioiden kautta voidaan seurata PCR-kokeilla. Monissa tapauksissa uusien virulenttien alatyyppien esiintyminen voidaan havaita ja seurata. Myös organismin alatyypit, jotka olivat vastuussa aiemmista taudinpurkauksista, voidaan määrittää PCR: llä.
Viruksen DNA voidaan havaita PCR: llä. Käytettyjen alukkeiden tulisi olla spesifisiä kohdesekvensseille viruksen DNA: ssa, ja PCR: ää voidaan käyttää diagnostisiin määrityksiin tai viruksen genomin DNA-sekvensointiin. PCR: n korkea herkkyys mahdollistaa viruksen havaitsemisen pian tartunnan jälkeen ja jopa ennen taudin oireiden ilmaantumista. Tällainen varhainen havaitseminen voi antaa lääkäreille laajemman hoitovalinnan. Viruksen määrä ( viruksen määrä ) potilaassa voidaan myös mitata PCR: ään perustuvilla DNA-kvantifiointitekniikoilla. Esimerkiksi PCR: n muunnosta (RT-PCR) käytetään koronavirustaudin 2019 virusgenomin havaitsemiseen .
Sairaudet, kuten hinkuyskä, aiheuttavat Bordetella pertussis -bakteerit. Tämä bakteeri aiheuttaa vakavan akuutin hengitystieinfektion, joka vaikuttaa useisiin eläimiin ja ihmisiin ja johtaa monien pienten lasten kuolemaan. Pertussis-toksiini on proteiini- eksotoksiini, joka sitoutuu solureseptoreihin kahdella dimeerillä ja reagoi erilaisten solutyyppien kuten T-lymfosyyttien kanssa, joilla on merkitystä solun immuniteetissa. PCR on tärkeä testaustyökalu, joka voi havaita hinkuyskätoksiinigeenin sekvenssit. Koska PCR: llä on korkea toksiiniherkkyys ja nopea läpimenoaika, se on erittäin tehokas hinkuyskän diagnosoinnissa viljelmään verrattuna.