Immunofluoresenssi

Immunofluoresenssi on tekniikka immunovärjäyksen , joka käyttää vasta-aineita, samoin kuin fluorokromeihin . Immunofluoresenssi mahdollistaa spesifisen proteiinin paljastamisen suoraan soluun fluoresenssin emissiolla . Siksi sen avulla voidaan määrittää paitsi proteiinin läsnäolo tai puuttuminen myös sen sijainti solussa tai kudoksessa.

Historiallinen

Fluoresenssin ilmiö löydettiin keskellä XIX : nnen  vuosisadan jonka Englanti tiedemies Sir George Gabriel Stokes . Hän havaitsi ensimmäisenä, että fluoriitti , mineraali , fluoresoi altistuessaan ultraviolettisäteille , ja antoi sille nimen "fluoresenssi".

Ensimmäinen immunofluoresenssia käyttävä työ on peräisin 1950-luvulta, jolloin vasta-aineet konjugoitiin kemiallisiin fluorokromeihin, kuten fluoreseiiniin .

Ensimmäiset fluoresoivat proteiinit (samanlaisia ​​kuin immunofluoresenssissa käytettävät fluorokromit) löydettiin paljon myöhemmin, 1960-luvulla GFP: llä ( Green Fluorescent Protein ), Osamu Shimomura ja Roger Y. Tsien . Meduusasta ( Aequorea victoria ) johdettu tämän proteiinin löytö ansaitsi heille kemian Nobel-palkinnon vuonna 2008. Nykyään monet immunofluoresenssissa käytetyt fluorokromit ovat GFP: n johdannaisia.

Immunofluoresenssin periaatteet.

Fluoresenssia on kahta tyyppiä. Ensinnäkin niin kutsuttu "luonnollinen" fluoresenssi tai auto-fluoresenssi, jonka solu spontaanisti lähettää. Mainita voidaan esimerkiksi kasvisolujen klorofylli. Sitten on fluorokromin aikaansaama fluoresenssi, kemiallinen aine, joka säteilee valoa, jos se viritetään tietyllä aallonpituudella.

Suora immunofluoresenssi

Immunofluoresenssissa voidaan suorittaa kahden tyyppisiä leimausmenetelmiä. Ensimmäinen on suora immunofluoresenssi. Tämän leiman aikana käytetään haluttua molekyyliä vastaan ​​suunnattua vasta-ainetta, nimeltään antigeeni. Tämä vasta-aine on kytketty fluorokromiin. Sitten valmisteen paljastamiseksi voidaan käyttää epifluoresenssimikroskooppia tai konfokaalimikroskooppia. Tämä tekniikka on edelleen yksi käytetyimmistä tieteellisessä tutkimuksessa.

Epäsuora immunofluoresenssi

Epäsuora immunofluoresenssi (IFI) perustuu kahden vasta-aineen peräkkäiseen käyttöön: ensimmäinen monoklonaalisen tyyppinen vasta-aine tunnistaa spesifisesti kiinnostavan proteiinin. Toinen polyklonaalisen tyyppinen vasta-aine on suunnattu primaarivasta-ainetta vastaan ​​(ensimmäinen).

Tämä on toinen merkintä. Tässä tapauksessa meillä on kaksi vasta-ainetta. Primaarinen vasta-aine on suunnattu haluttua antigeeniä vastaan. Sitten käytetään toista vasta-ainetta, joka on merkitty fluorikromilla ja jolla on korkea affiniteetti primaariseen vasta-aineeseen (kohdistettu primaarisen vasta-aineen isotyyppiä vastaan, se on sitten antiglobuliini ).

Hyödyt ja haitat

Etuina on mahdollisuus suorittaa useita leimoja samalle solunäytteelle, tämän menetelmän nopeus ja helppokäyttöisyys sekä hyvä luotettavuus. Lisäksi epäsuorassa immunofluoresenssissa valon voimakkuus kasvaa, koska primaarivasta-aineissa on useita sitoutumiskohtia, mikä mahdollistaa useiden sekundaaristen vasta-aineiden kiinnittymisen niihin.

Mutta on olemassa muutamia haittoja. Esimerkiksi väärien positiivisten tai väärien negatiivisten reaktioiden mahdollisuus, fluoresenssin asteen subjektiivinen arviointi ja valkaisun ilmiö. Näiden haittojen voittamiseksi on olemassa useita tekniikoita. Suorita ensinnäkin negatiivinen kontrolli epäsuoralle immunofluoresenssille, toisin sanoen laittaa vain sekundääriset (leimatut) vasta-aineet kosketukseen analysoitavan näytteen kanssa. Jos negatiivinen kontrolli on hyvä pesuvaiheen jälkeen, sen ei olisi pitänyt tuottaa fluoresenssia, koska sekundääriset vasta-aineet eivät voineet sitoutua, ja siksi ne lähtivät pesuvaiheen jälkeen. Sitten korkean resoluution ja suuren herkkyyden omaavan kameran käyttö vaimentaa valkaisua ja mahdollistaa kvantitatiivisen tutkimuksen hankinnasta.

Tekninen

Vaikka immunofluoresenssin periaate on yksinkertainen, käytännössä on otettava huomioon monet tekijät.

• Vasta-aineiden spesifisyys. Monoklonaalisia vasta-aineita tulee käyttää aina kun mahdollista.
• Epäspesifisten sivustojen estäminen
• Mahdolliset ristireaktiot, erityisesti kaksoismerkinnöissä epäsuoralla immunofluoresenssilla. Sitten on varmistettava, että sekundääriset vasta-aineet ovat spesifisiä vain liittyvälle primaarivasta-aineelle.
• Biokemialliset vuorovaikutukset proteiinien välillä, erityisesti hydrofobiset vuorovaikutukset. Lievää detergenttiä lisätään usein immunofluoresenssipuskureihin estämään näiden vuorovaikutusten häiritsemästä testiä.
• Näytteen autofluoresenssi. Jos näytteellä on luonnollinen fluoresenssi, valovalkaisu tulisi suorittaa ennen immunofluoresenssin jatkamista.
• Solunsisäisen proteiinin leimautumisen tapauksessa kalvot on läpäistävä etukäteen, jotta vasta-aine voi päästä soluun kohdeproteiinin löytämiseksi.
• On edullista tarkkailla vain yhtä fluoresenssia kerrallaan ja siksi käyttää fluorokromeja, joiden viritys- ja emissiospektrit eivät ole päällekkäisiä.

Käyttöalueet

Voimme erottaa kolme aluetta:

Diagnoosi

• Bakteriologiassa immunofluoresenssia käytetään bakteerien välittömään havaitsemiseen kehon nesteissä. Mutta myös anti-mikro-organismin vasta-aineiden etsimiseen epäsuoralla immunofluoresenssilla.
• Virologiassa suoraa immunofluoresenssia käytetään solu- tai virusantigeenin ulkonäön kinetiikan saavuttamiseen. Ja epäsuoraa immunofluoresenssia käytetään infektioviruksen testaamiseen.
• Patologisessa anatomiassa (biopsian ottaminen) suoraa immunofluoresenssia käytetään immunoglobuliinien tai komplementtiproteiinien kerrostumien havaitsemiseen kudoksissa. Sitten onkologiassa onkogeenien ilmentyminen voidaan kvantifioida sytofluorimetrialla. Lopuksi immunofluoresenssia voidaan käyttää siittiöiden laadun määrittämiseen hedelmättömyyden diagnosoimiseksi.

Perustutkimus

• Solujakauman havainnointi
• Solusyklianalyysi, mukaan lukien apoptoosi
• Solun aktivointi
• Molekyylihybridisaatio
• Solunsisäinen lokalisointi, voimme käyttää videomikroskopiaa , mutta myös rekombinanttiproteiineja .

Innovaatiot

• On olemassa 3D-kvantifiointi- ja rekonstruointiohjelmia yhdistettynä konfokaaliseen tai epifluoresenssimikroskooppiin. Myös dekonvoluutioohjelmalla, joka parantaa kuvan tai videon terävyyttä.
• Suuritehoinen solujen fenotyypitys esimerkiksi yhdeksänkymmentäkuusi kuoppaa olevalla levyllä.

Immunofluoresenssia käytetään soluissa viljelmässä (puhumme sitten immunosytokemiasta ) tai kudosleikkeissä ( immunohistokemia ).

Aiheeseen liittyvät artikkelit

• Fluoresoiva treponemaalinen vasta-aine
• Immunoglobuliini

Lähteet

1. AH Coons ja MH Kaplan , “  Antigeenin lokalisointi kudossoluissa; parannuksia menetelmässä antigeenin havaitsemiseksi fluoresoivien vasta-aineiden avulla  ", The Journal of Experimental Medicine , voi.  91, n o  1,1. st tammikuu 1950, s.  1–13 ( ISSN  0022-1007 , PMID  15395569 , PMCID  PMC2135948 , luettu verkossa , käytetty 12. huhtikuuta 2018 )
2. “  Kemian Nobel-palkinto 2008: palkittu fluoresoiva meduusa.  » , On culturesciences.chimie.ens.fr (käytetty 12. huhtikuuta 2018 )
3. [1]
4. Immunology, 4. painos, EM inter
5. Yleinen immunologinen tieto ja käytäntö, 8 asteen uudistettu ja täydennetty painos, MASSON
6. Julie G. Donaldson , "  UNIT 4,3 Immunofluoresenssivärjäys  ", Current Protocols in cell biology / toimitusneuvosto, Juan S. Bonifacino ... [et ai.] , Voi.  0 4,Toukokuu 2001, Unit - 4.3 ( ISSN  1934-2500 , PMID  18228363 , PMCID  PMC4709840 , DOI  10.1002 / 0471143030.cb0403s00 , luettu verkossa , käytetty 13. huhtikuuta 2018 )
7. [2]