RNA-Seq ( sekvensointi on RNA , RNA sekvensointi vuonna Englanti ) , jota kutsutaan myös haulikko sekvensointi transcriptome koko ( koko transcriptome haulikko sekvensointi Englanti), on tekniikka, joka käyttää korkean suoritustehon sekvensoinnin ( seuraavan sukupolven sekvensointi Englanti) tunnistamiseksi ja kvantifioi genomin transkriptiosta saatu RNA tietyssä ajankohdassa.
Solun transkriptio on dynaaminen, muuttuu jatkuvasti. Suuren läpäisykyvyn sekvensointitekniikat ovat mahdollistaneet solun DNA: n lukemisen emäksittäin. Nämä tekniikat mahdollistavat myös RNA: n lukemisen solussa, mikä helpottaa vaihtoehtoisten geenien silmukoinnin mekanismien ymmärtämistä , mukaan lukien transkriptionaaliset modifikaatiot , fuusiogeenit, nukleotidipolymorfismit ( SNP: t ) ja muutokset geeniekspressiossa . Lisäksi mRNA: n , RNA-sekvenssi tekniikka pystyy tunnistamaan muita tyyppejä RNA, kuten mikroRNA ( miRNA ), siirtää ribonukleiinihappo (tRNA, tRNA ) ja ribosomaalinen RNA: ta (rRNA, Englanti rRNA ). RNA-Seq-tekniikka on käyttökelpoinen geenien eksoni / intronimarginaalien määrittämiseen ja aiemmin merkittyjen 5'- ja 3'-päiden sijainnin tarkistamiseen.
RNA-Seq-tekniikalla tehtyihin tutkimuksiin sisältyy sellaisten muutosten tarkastelu, jotka tapahtuvat solussa infektioiden aikana, ja muutokset geeniekspressiossa syöpätutkimuksia varten.
Ennen korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikoiden käyttöönottoa geeniekspressiomassatutkimukset tehtiin ensisijaisesti mikrorake- tekniikan avulla .
RNA-Seq: n yleinen metodologia kuvataan päinvastoin. Yleisin tapa on kohdistaa polyadenyloidut RNA: t, koska ne edustavat stabiileja mRNA: ita, eikä niitä sen vuoksi kohdenneta hajoamiseen, mikä siis vastaa pääasiassa mRNA: ita, joiden tarkoituksena on translaatio proteiiniksi. Lisäksi polyadenyloidun RNA: n valinta mahdollistaa sellaisten ribosomaalisten RNA: iden eliminoinnin, jotka eivät ole tämän ilmiön alaisia. On huomattava, että on olemassa muita protokollia, jotka kohdistuvat muihin RNA: hin, erityisesti mikro-RNA: hin, samoin kuin syntyviin RNA: hin tai jopa koodaamattomiin RNA: hin . Lopuksi, vaikka yleisin menetelmä kohdistaa solun kokonais-RNA: n, on olemassa tiettyjä protokollia ydin- tai sytoplasmisten RNA: iden eristämiseksi tutkimuksen laajuudesta riippuen.
Sekvensointikirjaston luominen voi vaihdella alustasta suuritehoiseen sekvensointialustaan, joista kullekin on monia sarjoja, jotka on omistettu erityyppisten kirjastojen luomiseen ja tuloksena olevien sekvenssien mukauttamiseen kirjastojensa erityisvaatimuksiin. . Analysoitujen tuotteiden luonteen vuoksi kunkin tekniikan välillä on kuitenkin yhtäläisyyksiä, yleinen periaate pysyy olennaisesti samana. Usein mRNA-analyysien aikana 3'-polyadenyloidut pyrstöt (poly (A)) kohdennetaan varmistamaan koodaavien RNA: iden ero koodaamattomista RNA: ista. Tämä saavutetaan lisäämällä kovalenttisesti poly (T) oligonukleotideja substraattiin. Tällä hetkellä monissa tutkimuksissa käytetään magneettisia helmiä tähän tarkoitukseen.
Tutkimukset polyadenyloimattoman transkriptomin osista ovat osoittaneet, että poly (T) magneettihelmiä käytettäessä läpivirtaus voi auttaa löytämään tärkeitä ei-koodaavia geenejä, jotka muuten olisivat jääneet väliin. Lisäksi, koska ribosomaalinen RNA edustaa yli 90% tietyn solun kokonais-RNA: sta, tutkimukset ovat osoittaneet, että sen eliminointi hybridisoimalla näihin RNA: hin kohdistetut spesifiset koettimet lisäävät merkittävästi solun kapasiteettia. loput transkriptiosta.
Seuraava vaihe on käänteiskopiointi , jonka tarkoituksena on muuntaa RNA cDNA: ksi. Satunnaisten alukkeiden käänteiskopioinnin 5'-poikkeamien korjaamiseksi ja alukkeiden sitoutumiskohtiin vaikuttavien sekundaaristen rakenteiden muodostumisen vähentämiseksi käytetään yleensä RNA: n hydrolyysiä 200-300 nukleotidin fragmenteiksi. näitä mahdollisia ongelmia. Tällä menetelmällä on kuitenkin rajoituksia: vaikka yleensä transkriptioiden runko (vastaava geenin runko) muunnetaan tehokkaasti cDNA: ksi, 5'- ja 3'-päihin tehdään vähemmän. Siksi tutkijat päättävät soveltaa tai jättää huomiotta tämän vaiheen tietyssä tutkimuksessa asetettujen tavoitteiden mukaisesti.
Kun cDNA on syntetisoitu, se voidaan edelleen fragmentoida, jotta saavutetaan haluttu fragmentin pituus käytetylle sekvensointijärjestelmälle, kuten esimerkiksi Illumina- tekniikalle .
Sekvensointi antaa sitten mahdollisuuden arvioida kunkin geenin transkriptioiden runsaus, ts. Kuinka monta kertaa sama transkriptio on sekvensoitu. Siten on mahdollista määrittää geenien suhteellinen ilmentyminen tietyssä fysiologisessa tilassa vertailufysiologiseen tilaan verrattuna.
Geenien yhteisilmentämisverkot