DNA: n uutto on tekniikka eristämiseksi deoksiribonukleiinihappo (DNA) ja solujen tai kudosten . Näin uutettua DNA: ta voidaan sitten käyttää molekyylibiologiseen tutkimukseen , kuten sekvensointiin , PCR: ään tai kloonaukseen . DNA: n uuttamiseksi on olemassa erilaisia protokollia, jotka seuraavat suunnilleen samaa virtauskaaviota:
Eri muunnelmia käytetään riippuen siitä, yritetäänkö purkaa genominen DNA ( analysoitujen solujen kromosomista ) vai plasmidi-DNA: sta ( plasmidista, jota useimmiten kantavat bakteerisolut , kuten Escherichia coli ). Nykyään on olemassa kaupallisia sarjoja näiden uuttojen suorittamiseksi nopeasti käyttövalmiilla reagensseilla.
Aloitamme yleensä solujen tai kudosten hajotuksella, joka mahdollisesti koostuu jauhatuksesta, jota seuraa uutto pesuaineilla , jotka hajottavat kalvojen lipidikaksoiskerrokset ja denaturoivat proteiinit ja erityisesti kalvoon liittyvät proteiinit . kromatiini . Saatu liuos on yleensä hyvin viskoosi, koska näin vapautunut DNA muodostaa hyvin pitkiä filamentteja, jotka vastustavat hydrodynaamisia virtauksia.
Seuraava vaihe on liuoksen poistaminen proteiinista, joka suoritetaan uuttamalla käyttäen orgaanisia liuottimia, yleensä fenolia, johon on lisätty enemmän tai vähemmän kloroformia . Denaturoidut proteiinit muodostavat sakan fenoli-vesi-rajapinnalla, kun taas DNA pysyy liuoksessa vesifaasissa, joka otetaan talteen dekantoimalla tai sentrifugoimalla.
DNA saostetaan sitten lisäämällä etanolia tai isopropanolia vesifaasiin, kerätään sentrifugoimalla ja liuotetaan puskuriin. Fenolin ja muiden epäpuhtauksien jäämien poistamiseksi on vihdoin mahdollista suorittaa dialyysi tai puhdistusvaihe preparatiivisella kromatografialla .
Plasmidi-DNA: n valmistus bakteereista on yksi yleisimmistä molekyylibiologian tekniikoista , joka tunnetaan myös miniprep- , midiprep- ja maxiprep-nimillä lyhennettynä käytetyn bakteeriviljelmän tilavuudesta riippuen. Uuttamisperiaate tunnetaan emäksisenä hajotuksena . Tämä menetelmä mahdollistaa bakteerien sisältämän plasmidin DNA: n selektiivisen valmistamisen poistamalla samalla DNA bakteerikromosomista. Tämän menetelmän periaate on solujen hajotus pesuaineen ( natriumdodekyylisulfaatin ) avulla soodan läsnä ollessa , pH-arvossa 13. Tässä hyvin emäksisessä pH: ssa DNA denaturoidaan , toisin sanoen - sanoa, että kaksoiskierteen kaksi säikettä on erotettu toisistaan. Liuos neutraloidaan sitten nopeasti, mikä aiheuttaa äkillisen renaturoitumisen (DNA-dupleksin säikeiden uudelleensitoutuminen). Hyvin pitkä kromosomaalinen DNA (~ 10 (emäsparia) ei pari täysin ja muodostaa liukenemattomia punoksia. Lyhyt (~ 103 emäsparia) plasmidi-DNA onnistuu uudelleen assosioitumaan ja pysyy liuoksessa. Sitten lajit erotetaan sentrifugoimalla. Saostuneet proteiinit poistetaan myös detergentillä ja kromosomaalisella DNA: lla. Liuokseen jäänyt plasmidi-DNA konsentroidaan sitten saostamalla alkoholilla.
Tämän menetelmän eri muunnelmia tai parannuksia on erityisesti monissa kaupallisissa sarjoissa . Viimeksi mainitut sisältävät usein pieniä pylväitä kromatografista ioninvaihtohartsia , mikä mahdollistaa saadun DNA: n puhtauden parantamisen. RNA: iden poistamiseksi lisätään usein ribonukleaaseja, jotka hydrolysoivat selektiivisesti nämä nukleiinihapot, jolloin DNA pysyy ehjänä.