In molekyylibiologian , joka on morfolino on eräänlainen molekyylin käyttää muuttamaan geenin ilmentymistä . Morfolino oligonukleotidi tekniikka on antisense- tekniikka , jota käytetään lohkon pääsy muiden molekyylien spesifisiin sekvensseihin tiettyjen nukleiinihappomolekyylien . Ne voivat estää muiden molekyylien pääsyn ribonukleiinihappojen (RNA) emäspariliitospinnan pienille alueille (noin 25 emästä ). Morfolinoihin viitataan joskus nimellä PMO , englanninkielinen lyhenne, joka tarkoittaa fosforodiamidaattimorfolinooligoa . Sana "morfolino" voi esiintyä muissa kemiallisissa nimissä. Se koskee kemikaaleja, jotka sisältävät kuuden alayksikön morfoliinirenkaan; tässä artikkelissa käsitellään vain morfolinoantisense-oligonukleotideja.
Biologisessa tutkimuksessa, morpholinos käytetään yleensä välineet käänteisen genetiikan mukaan inaktivoimalla toiminnan geenin. Tämä saavutetaan estämällä soluja syntetisoimasta kohdennettua proteiinia tai muuttamalla pre-mRNA: n silmukointia . Geeniekspression inaktivointi on tehokas menetelmä tietyn proteiinin toiminnan tutkimiseen. Samoin spesifisen eksonin silmukoinnin indusointi voi auttaa määrittämään eksonin koodaaman proteiinin osan toiminnan. Näitä molekyylejä on käytetty useiden malliorganismien tutkimiseen, mukaan lukien hiiret , seeprakalat ja ksenopot .
Morfolinoja kehitetään myös farmaseuttisena terapiana, joka kohdistuu patogeenisiin organismeihin , kuten bakteereihin tai viruksiin, ja geneettisten sairauksien hoitojen parantamiseen . Nämä synteettiset oligonukleotidit on suunnitellut tohtori James E. Summerton ( Gene Tools , LLC) ja ne on kehitetty yhteistyössä Dr. Dwight D. Wellerin ( AVI BioPharma Inc. ) kanssa.
Morfolinot ovat synteettisiä molekyylejä, jotka johtuvat nukleiinihappojen luonnollisen rakenteen uudelleenjärjestelystä. Tavallisesti 25 emästä pitkä, ne sitoutuvat komplementaarisiin RNA-sekvensseihin emäsparin muodostamalla . Rakenteellisesti, vaikka morfolinoilla on klassisia typpiemäksiä, ne eroavat DNA: sta siinä mielessä , että nämä typpiemäkset ovat kiinnittyneet morfoliinirenkaisiin deoksiriboosin sijasta . Nämä morfoliinirenkaat on kytketty yhteen fosforodiamidaattiryhmillä fosfaattiryhmien sijaan . Tämän visualisointi on helpompaa viittaamalla kuvioon 1 ja vertaamalla RNA-juosteen ja morfolino-juosteen rakenteita. Anionisten fosfaattiryhmien korvaaminen varauksettomilla fosforodiamidaattiryhmillä eliminoi ionisaation tavallisella fysiologisella pH-alueella, joten organismien tai solujen morfoliinot ovat varauksettomia molekyylejä. Morfolinon koko selkäranka koostuu näistä muunnetuista alayksiköistä. Morfolinoja käytetään yleisimmin yksijuosteisina oligonukleotideina, joten morfolino-juosteesta muodostuneita heteroduplexeja ja komplementaarista DNA: ta voidaan käyttää yhdessä kationisten sytosolisten reagenssien annostelun kanssa .
Toisin kuin monet antisense-rakennetyypit, kuten fosforotioaatit tai pienet häiritsevät RNA: t, morfolinot eivät hajota RNA-molekyylejä, joihin ne kiinnittyvät. Morfolinot vaikuttavat steeristen esteiden avulla sitoutumalla kohdesekvenssiinsä RNA: lla, ne pääsevät molekyylien tietoon, jotka puuttuessaan ovat vuorovaikutuksessa RNA: n kanssa.
Morfolino-oligonukleotideja käytetään usein alkiossa transkriptoidun spesifisen mRNA: n roolin tutkimiseen. Kehitysbiologit ruiskuttavat morfolino-oligonukleotideja seeprakalan , ksenopuksen , kanan ja merisiilin muniin tai alkioihin, mikä tuottaa morfantteja alkioita . Sopivalla sytoplasman siirtojärjestelmällä morfolinoja käytetään tehokkaasti soluviljelmässä .
Morpholinos kehitetään lääkkeenä nimellä " NeuGene " AVI biolääketieteen Inc. Niitä on käytetty nisäkkäillä vaihtelee hiirillä ja ihmisillä ja jotkut ovat yleisesti testattu kliinisissä kokeissa kuin terapiaa. Syöpälääkkeiden tai Duchennen lihasdystrofia.
In eukaryoottiset organismit , esi-mRNA on transkriboidaan tumaan, intronit ovat saumattu , ja sitten kypsän mRNA viedään sen ydin on sytoplasmaan . Pienet ribosomien alayksiköt alkavat yleensä kiinnittymällä mRNA: n toiseen päähän ja yhdistyvät siellä erilaisilla initiaatiotekijöillä muodostaen siten aloituskompleksin. Aloituskompleksi kulkee mRNA-juosteen läpi, kunnes se kohtaa aloituskodonin , jolloin ribosomin suuri alayksikkö kiinnittyy pieneen alayksikköön. Käännös on proteiini alkaa. Tätä koko prosessia kutsutaan geeniekspressioksi. Se on prosessi, jolla geenitiedot , jotka koodataan typpipitoisten emästen peräkkäin DNA: ssa, muutetaan proteiinirakenteeksi. Morfolino voi modifioida silmukoinnin tai estää translaation morfolinon emässekvenssistä riippuen.
Sidottu 5 tulkitsemattoman aluetta lähetti-RNA (mRNA), morpholinos voivat häiritä etenemistä ribosomaalisen aloituskompleksin päässä 5 ' cap aloituskodonia. Tämä inaktivointi ja geenin ilmentymisen estää translaation n koodaavan alueen kohdennettu transkriptin . Tämä on hyödyllistä kokeellisesta näkökulmasta, kun tutkija haluaa tietää tietyn proteiinin toiminnan. Morfolinot tarjoavat kätevän tavan inaktivoida kohdeproteiinin ilmentyminen ja tutkia kuinka inaktivaatio muuttaa solua tai organismia. Jotkut morfoliinot inaktivoivat ekspression niin tehokkaasti, että olemassa olevien proteiinien hajoamisen jälkeen kohdeproteiineista ei voida havaita sähkösiirtona .
Morpholinos voi häiritä vaiheet pre-mRNA: n prosessointiin , joko estämällä pariutumisen pienen ydin- ribonukleoproteiinikompleksin ( snRNP ) niiden tavoitteiden reunalla intronien pre-mRNA: n säie tai estämällä nukleofiilisen adeniinit. , Siten estäen laslasrakenteiden silmukoinnista tai häiritsemällä säätelyllisten liitosproteiinien, kuten ”silmukan vaimennimet” ja ” silmukan tehostajat ”, kiinnittymistä . U1: n (luovuttajakohdassa) tai U2 / U5: n (puolet polypyrimidiinillä ja puolet akceptorikohdassa) kiinnittymisen estäminen snRNP: t voivat aiheuttaa silmukointimuutoksia , yleisesti eksonien poissulkemisen M. mRNA: n kypsymisestä. Tiettyjen liitoskohteiden kohdentaminen johtaa intronin poissulkemiseen , kun taas piilotettujen liitoskohtien aktivointi voi johtaa osittaisiin sulkeutumiseen tai poissulkemiseen. Kohteet U11 / U12 snRNP-komplekseista voidaan myös estää. Silmukkamodifikaatio voidaan validoida käänteistranskriptiopolymeraasiketjureaktiolla ( RT-PCR ), ja se ilmenee elektroforeesigeelissä RT-PCR-tuotteen nauhan siirtymällä.
Morfolinoja on käytetty estämään mikroRNA: iden aktiivisuus ja estämään ribotsyymien aktiivisuus . Morfolinot estivät U2: n ja U12: n snRNP: n toimintaa. Liukuviin mRNA- sekvensseihin kohdistavat morfolinoset koodaavilla alueilla voivat aiheuttaa lukukehyksen siirtymän . Morfolinoiden aktiivisuus tätä erilaista kohdetta vastaan viittaa siihen, että morfolinoja voidaan käyttää yleiskäyttöisinä välineinä estämään proteiini- tai nukleiinihappovaikutukset mRNA: iden kanssa.
Gene Tools, LLC ja AVI BioPharma Inc. ovat yrityksiä, jotka vaativat immateriaalioikeuksia morfolinooligonukleotidien eri näkökohdista.