Streptavidiini

Streptavidiini
Streptavidiinin graafinen esitys (1p)
Pääpiirteet
Streptomyces avidinii

Streptavidiini on proteiini on 52,8 kDa: n puhdistettu bakteerista Streptomyces avidinii . Streptavidiinihomotetrameereillä on poikkeuksellisen korkea affiniteetti biotiiniin (nimikkeistöjen mukaan kutsutaan myös B7-, B8- tai H-vitamiiniksi). Näin ollen, joilla on dissosiaatiovakio (K d ) suuruusluokkaa 10 -14 mol / l, ei-kovalenttisen sitoutumisen biotiini streptavidiiniin on yksi vahvimmista vuorovaikutusten luonnossa. Streptavidiinia käytetään laajalti molekyylibiologiassa ja bionanotekniikassa johtuen streptavidiini-biotiinikompleksin vastustuskyvystä orgaanisiin liuottimiin , denaturointiaineisiin (esim. Guanidiniumkloridi ), detergentteihin (esim. SDS , Triton ), proteolyyttisiin entsyymeihin ja äärimmäisiin lämpötiloihin ja pH: han .

Rakenne

Rakenne on strepatavidin kiteen sitoutunut biotiiniin on julkaistu kaksi joukkueiden 1989. rakenne voidaan määrittää käyttäen useita poikkeavia diffraktio tekniikoita Hendrickson et ai. at Columbia University , ja käyttämällä useita isomorfiset korvaaminen tekniikka, Weber et ai. klo EI DuPont Keski tuotekehitysosasto . Siitä asti kunhelmikuu 2012, Proteiinitietopankkiin on talletettu 135 rakennetta . Natiivin 159-tähdeproteiinin N- ja C-päät leikataan pois, jolloin saadaan lyhyempi streptavidiini, joka yleensä koostuu tähteistä 13-139. Tämä muunnos on välttämätön korkean affiniteetin saavuttamiseksi biotiiniin. Sekundaarirakenne streptavidiinin monomeerin koostuu 8 vastakkaissuuntaiset beeta joka taita tertiaarisen antiparallel beeta-sylinterin rakenne . Biotiinia sitova kohta sijaitsee jokaisen beetasäiliön päässä. Neljä identtistä streptavidiinimonomeeria yhdistyvät, jolloin saadaan streptavidiinin tetrameerinen kvaternaarinen rakenne. Kunkin beetasäiliön biotiinia sitova kohta koostuu tynnyrin sisällä olevista tähteistä, jotka liittyvät naapurialayksikön konservoituneeseen Trp120-tähteeseen. Tällä tavoin kukin alayksikkö vaikuttaa naapurialayksikön sitoutumiskohtaan, jolloin tetrameeriä voidaan pitää funktionaalisten dimeerien dimeerinä.

Alkuperät, joilla on suuri affiniteetti biotiiniin

Streptavidiini-biotiinikompleksin lukuisat kristallografiset rakenteet ovat tuoneet esiin näiden kahden yhdisteen välisen huomattavan affiniteetin. Ensinnäkin streptavidiinin ja biotiinin sitoutumistaskun välillä on vahva konformatiivinen komplementaarisuus. Sitten kahden molekyylin välisen sidoksen aikana muodostuu suuri vetysidosten verkosto . Täten on olemassa 8 vetysidosta, jotka muodostuvat suoraan sitoutumistaskun tähteistä, jotka muodostavat ensimmäisen kerroksen ja käsittävät tähteet Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 ja Asp128. On myös toinen vetysidosten kerros, joka sisältää tähteet, jotka ovat vuorovaikutuksessa ensimmäisen kerroksen alkupäässä olevien tähteiden kanssa. Streptavidiini-biotiiniaffiniteetti kuitenkin ylittää tehokkaasti ennusteet, jotka on saatu pelkästään näiden vetysidosten tuntemuksesta, mikä viittaa toisen mekanismin olemassaoloon, joka vaikuttaa tähän korkeaan affiniteettiin. Biotiinia sitova tasku on luonteeltaan hydrofobinen , ja on olemassa monia hydrofobisia vuorovaikutuksia ja kontakteja, joita van der Waalsin voima välittää, kun biotiini on sitoutumistaskussa, mikä voi osallistua vahvaan affiniteettiin. Tätä hypoteesia vahvistaa taskussa säilyvien tryptofaanijäämien olemassaolo . Lopuksi biotiinin sitoutumiseen liittyy beetalevyjä 3 ja 4 yhdistävän joustavan silmukan stabiloituminen, joka lukitsee biotiinin sitoutumistaskussa vyön tavoin ja myötävaikuttaa biotiinin dissosiaation erittäin hitaaseen nopeuteen.

Useimmat yritykset streptavidiinin modifioimiseksi ovat johtaneet affiniteetin vähenemiseen biotiiniin, mikä on odotettavissa ottaen huomioon sitoutumisjärjestelmän optimointitaso. Kuitenkin äskettäinen streptavidiinimutantti, nimeltään traptavidiini, osoitti 10-kertaisesti pienemmän biotiinin dissosiaation kuin alkuperäinen, samoin kuin lisääntyneen termisen ja mekaanisen stabiilisuuden. Tähän dissosiaation vähenemiseen liittyy assosiaatioprosentin kaksinkertainen lasku. Tämän proteiinin jakelee Oxfordin yliopiston biokemian laitos .

Käyttö biotekniikassa

Proteiinin yleisimpiä käyttötapoja on erilaisten biomolekyylien puhdistus tai havaitseminen. Vahvaa streptavidiini-biotiinisidosta voidaan käyttää kiinnittämään erilaisia ​​biomolekyylejä toisiinsa tai kiinteään alustaan. Vakavat olosuhteet ovat välttämättömiä streptavidiini-biotiinisidoksen katkaisemiseksi, usein denaturoimalla kiinnostuksen kohteena oleva proteiini puhdistuksen aikana. On kuitenkin osoitettu, että lyhyt inkubointi vedessä vähintään 70 ° C voi rikkoa vuorovaikutuksen palautuvasti ja ilman denaturoivaa streptavidiinia, mikä sallii proteiinin uudelleenkäytön kiinteällä alustalla. Toinen Strep-tag-niminen sovellus on järjestelmä, joka on optimoitu proteiinien puhdistamiseksi ja havaitsemiseksi. Streptavidiinia käytetään laajalti Western blot- tai immunoentsymaattisissa kokeissa, konjugoituna reportterimolekyyleihin, kuten piparjuuriperoksidaasiin . Streptavidiinia on käytetty myös nanobioteknologian kehittämisen aikana, jolloin biologisten molekyylien, kuten proteiinien tai lipidien, käyttö on välttämätöntä nanometrisen mittakaavan rakenteiden luomiseksi. Tässä yhteydessä streptavidiinia voidaan käyttää rakennusmateriaalina biotinyloidun DNA-molekyylin sitomiseksi hiiliseinämisten nanoputkien tai jopa monikulmioisten DNA-kompleksien rakennustelineiden luomiseksi. Tetrameeristä streptavidiinia on käytetty myös kiinnityspisteenä, jonka ympärille muut proteiinit voidaan järjestää joko affiniteettimerkillä, kuten Strep-tag- tai Avitag-menetelmillä, tai SpyTag-tyypin fuusion avulla.

Ennalta kohdennettu immunoterapia

Immunoterapia pretargeted käyttäen streptavidiinilla, joka on konjugoitu vasta-aine monoklonaalista vasta-ainetta vastaan antigeenille spesifinen syöpäsolun jälkeen syötettiin biotiinin radioaktiivisesti jotta saadaan säteilyä vain syöpäsolun . Ensimmäiset sudenkuopat sisältävät streptavidiinin kyllästymisen endogeenisellä biotiinilla ja munuaisten suuren radioaktiivisen altistumisen, koska streptavidiini pystyy adsorboitumaan soluihin. Tällä hetkellä uskotaan, että tämä sitoutumisominaisuus tarttuviin soluihin, kuten aktivoituneisiin verihiutaleisiin tai melanoomiin, johtuu integraatin sitoutumisesta, jota välittää streptavidiinin RYD-sekvenssi.

Variantit, joilla on kontrolloitu määrä biotiinia sitovia kohtia

Monovalentti streptavidiini vs. monomeerinen streptavidiini

Streptavidiini on tetrameeri, ja kukin alayksikkö sitoo biotiinia samalla affiniteetilla. Multivalenssi on etu tietyissä sovelluksissa, esimerkiksi kun aviditeettivaikutus parantaa streptavidiiniin sitoutuneiden molekyylien kykyä havaita spesifiset T-solut. Muissa tapauksissa, kuten streptavidiinin käyttö spesifisten proteiinien kuvantamiseen soluissa, monivalenssi voi häiritä kiinnostavan proteiinin toimintaa. Monovalenttinen streptavidiini on tetrameerisen streptavidiinin rekombinanttimuoto, jolla on ainutlaatuinen toiminnallinen biotiinia sitova kohta. Tämän sivuston affiniteetti on 10 - 14 mol / L, eikä se voi aiheuttaa epäspesifistä sitoutumista. Tämän proteiinin jakelee Oxfordin yliopisto. Tämän proteiinin sovelluksiin kuuluu solupinnan reseptorien fluoresoiva seuranta, alueiden tunnistaminen elektronikryomikroskopiaa varten, DNA- origamin koristelu .

Monomeerinen streptavidiini on streptavidiinin rekombinanttimuoto, joka sisältää mutaatiot, jotka hajottavat tetrameerin monomeeriksi, jolloin on mahdollista lisätä näin eristetyn alayksikön liukoisuutta. Monomeerisen streptavidiinin eri versioilla on affiniteetti 10-7 mol / L10-8 mol / L, eivätkä ne siksi ole ihanteellisia leimaussovelluksiin, mutta ovat hyödyllisiä puhdistuksessa, jossa sitoutumisen palautuvuus on toivottavaa.

Määritelty kaksiarvoinen strepatavidiini

Streptavidiinia, jossa on täsmälleen kaksi biotiinia sitovaa kohtaa, voidaan tuottaa sekoittamalla alayksiköitä toiminnallisen sitoutumiskohdan kanssa ja ilman sitä, mitä seuraa puhdistaminen ioninvaihtokromatografialla . Toiminnallisilla kohdilla on sama biotiinia sitova stabiilisuus kuin villityypin streptavidiinilla. Kaksiarvoiset streptavidiinit, joissa on kaksi toiminnallista sitoutumiskohtaa, jotka on liitetty toisiinsa (cis-kaksiarvoinen) tai erotettu (trans-kaksiarvoinen), voidaan puhdistaa erikseen.

Vertailu avidiiniin

Streptavidiini ei ole ainoa proteiini, joka pystyy sitomaan biotiinia suurella affiniteetilla. Avidin pystyy erityisesti sitomaan biotiinia suurella affiniteetilla. Alun perin munanvalkuaisesta eristetyllä avidiinilla on vain 30% homologiaa streptavidiinin kanssa, mutta melkein identtiset sekundääriset, tertiääriset ja kvaternaariset rakenteet. Se on voimakkaampi affiniteetti biotiiniin (K d ~ 10 -15 M), mutta on glykosyloitu, positiivisesti varautunut, on pseudo- katalyyttinen aktiivisuus (se voi edistää emäksinen hydrolyysi esterin välinen sidos biotiinin ja ryhmä nitrofenoli) ja on voimakkaampi taipumus koota. Lisäksi streptavidiini sitoutuu paremmin biotiinikonjugaatteihin. Avidiinilla on pienempi affiniteetti kuin streptavidiinilla, kun biotiini on konjugoitu toiseen molekyyliin, huolimatta vahvemmasta affiniteetista vapaaseen biotiiniin.

Streptavidiinin isoelektrinen piste on noin 5 (vaikka rekombinanttimuotoa, jolla on neutraali isoelektrinen piste, on kaupallisesti saatavilla). Koska sokeria ja tätä neutraaliin lähellä olevaa isoelektristä pistettä ei ole, streptavidiinin etuna on paljon vähemmän epäspesifisiä sidoksia kuin avidiinilla. Deglykosyloitu avidiini (NeutrAvidin) on kooltaan, isoelektrisellä pisteellään ja epäspesifisellä sitoutumisellaan paremmin verrattavissa streptavidiiniin.

Viitteet

1. Green, New Mexico (1975).
2. Hendrickson, WA (1989).
3. Weber, PC (1989).
4. DeChancie, Jason; Houk, KN (2007).
5. Chivers, Claire E; Crozat, Estelle; Chu, Calvin; Moy, Vincent T; Sherratt, David J; Howarth, Mark (2010).
6. Holmberg, Anders; Blomstergren, Anna; Pohjoinen, Olof; Lukacs, Morten; Lundeberg, Joakim; Uhlén, Mathias (2005).
7. Osojic, GN; Hersam, MC (2012).
8. Zhang, C; Tian, ​​C; Guo, F; Liu, Z; Jiang, W; Mao, C (2012).
9. Fairhead, M; Veggiani, G et ai. (2014).
10. Alon, R; Bayer, EA; Wilchek, M (1992).
11. Xu, X; Screaton, GR (2002).
12. Howarth, Mark; Chinnapen, Daniel JF; Gerrow, Kimberly; Dorrestein, Pieter C; Grandy, Melanie R; Kelleher, Neil L; El-Husseini, Alaa; Ting, Alice Y (2006).
13. Wu, SC; Wong, SL (2005).
14. Lim, K (2011).
15. Fairhead, M. et ai. (2013).