Entsyymi-immunomääritys ELISA ( englanninkielinen entsyymiin liittyvä immunosorbenttimääritys , kirjaimellisesti "tekniikan entsyymiin liittyvä immunosorbentti", toisin sanoen entsyymi-immunomäärityksen kiinteä tukitekniikka) on laboratoriotutkimus. Tämä menetelmä on pääasiassa käytetään havaitsemaan läsnä ollessa vasta-aine tai antigeeni on näytteessä .
Tämä biokemiallisen analyysin tekniikka kuuluu yleisempiin immunoentsymaattisten detektiotekniikoiden (tai EIA- entsyymi-immunomääritysten ) puitteisiin, joissa noudatetaan tietyllä vasta-aineella tutkitun antigeenin (tai päinvastoin antigeenin tutkiman vasta-aineen) tunnistamista. entsyymin katalysoimalla reaktiolla, joka vapauttaa värillisen komponentin, jonka määrä määritetään spektroskopialla . Tätä varten antigeeni tunnistetaan vasta-aineella, joka on kovalenttisesti kytketty entsyymiin (tai päinvastoin, vasta-aine tunnistaa leimattu antigeeni). Leimatun molekyylin sitoutuminen johtaa värillisen tai fluoresoivan signaalin emissioon vasta-aineeseen kytketyn entsyymin kromogeenisen tai fluorogeenisen substraatin käytön jälkeen. Nämä tekniikat on vastustettava radioimmunologisia määrityksiä (tai RIA radioimmunomäärityksiä varten ), joissa leimaaminen tapahtuu radioelementillä, jonka radiologinen aktiivisuus mitataan hajoamisten lukumääränä sekunnissa. Tekniikan toteuttamisen helpottamiseksi, erityisesti kun kyseessä on suuri määrä analysoitavia näytteitä, halutulle antigeenille spesifinen vasta-aine tai halutun vasta-aineen tunnistama antigeeni kytketään käytettyyn kantajaan, joka on peitetty sillä, tästä johtuen immunoabsorptiotekniikan nimi. Toimintaprotokollissa on useita muunnelmia, jotka antigeenitunnistuksen spesifisyyden tai herkkyyden lisäämiseksi (epäsuora, kerros- tai kilpaileva ELISA) on mahdollista.
Koska ELISA: ta voidaan käyttää sekä antigeenin että vasta-aineen läsnäolon arvioimiseen näytteessä, se on tehokas työkalu sekä seerumin vasta- ainepitoisuuksien määrittämiseen (kuten HIV-testissä tai HIV-testissä. Niilin virus ), vain havaita antigeenin läsnäolo. Se on löytänyt sovelluksia myös elintarviketeollisuudessa elintarvike-allergeenien , kuten maidon , maapähkinöiden , pähkinöiden ja munien , havaitsemiseksi . Se on yksinkertainen, helppokäyttöinen ja halpa testi. Sitä rajoittaa spesifisen vasta-aineen saatavuus.
Antigeenin havaitsemisen herkkyyden parantamiseksi vasta-aine, joka tunnistaa halutun antigeenin, ei saa olla kytketty entsyymiin, mutta se voidaan tunnistaa spesifisesti toisen vasta-aineen avulla, joka itse kytketään entsyymiin .
Entsyymi toimii tehostajana: vaikka muutama entsyymiin konjugoitu vasta-aine kiinnittyisi, entsyymi katalysoi monien signaalien muodostumista, mikä tekee testistä erittäin herkän, mutta lisää myös väärien positiivisten määrää . Siksi on loogista säätää kontrollikaivoista.
Ns. Epäsuoran ELISA: n vaiheet, joita käytetään yleisimmin seerumin vasta-ainepitoisuuden määrittämiseen, ovat:
Sandwich-ELISA on tämän tekniikan harvinaisempi (kliininen) muunnos, jota käytetään antigeeninäytteen havaitsemiseen seerumista tai muusta näytteestä. Tämä tekniikka on toisaalta hyvin yleistä tutkimuksessa.
Prosessi tapahtuu laajasti seuraavasti:
Kuten on havainnollistettu, on kuitenkin yleensä yksi lisävaihe, detektiovasta- aineiden lisääminen, jotta vältetään vasta-aineiden muodostuminen konjugoituna entsyymiin kullekin antigeenille . Kytketyn entsyymin käyttö, joka tunnistaa muiden vasta-aineiden Fc-osan, sallii sen käytön monissa tilanteissa ja vähentää menettelyn kustannuksia.
Tämä muunnos sallii antigeenin määrityksen sitovan kilpailun periaatetta käyttäen:
Siksi leimattujen antigeenien (tiedossa oleva määrä) ja leimaamattomien (määrättävä määrä) välillä on kilpailua niiden sitoutumisesta puuttuviin vasta-aineisiin. Siten mitä suurempi analysoitavien antigeenien määrä, sitä suurempi on niiden osuus vasta-aineiden pidättämissä antigeeneissä, ja heikompi signaali on. Toisaalta, jos antigeenin alkupitoisuus on pieni, signaali on vahva.
ELISA voidaan suorittaa määrällisiin tai laadullisiin tarkoituksiin:
Suoraa ELISA: ta käytetään erilaisten proteiinien määritykseen. Joitakin esimerkkejä peräisin sovelluksia lääketieteen farmakologian: kilpirauhashormonit, lääkeaineen pitoisuus (arvioida noudattaminen ja / tai säätää annostusta ), jne.
Tunnetuin sovellus yleisölle on ensilinjan HIV- testaus .
ELISA-tekniikka mahdollistaa havaitsemisen anti HIV -vasta-aineiden että veren seerumissa (siksi termi "seropositiivisista" tai "seronegatiivisia). Tämä tekniikka on hyvin herkkä (useimmissa tapauksissa havaitaan, ja" vääriä negatiivisia "(= negatiivinen testit, kun potilas on seropositiivinen) on melkein suljettava pois, ainakin jos testi suoritetaan kolmen kuukauden kuluessa tarttuvasta kontaktista) ja hyväksyttävä spesifisyys (alhainen " väärien positiivisten " määrä (= positiivinen testi vasta-aineen reaktiolla positiivisen anti-HIV-serologian tapauksessa näytteille olisi kuitenkin tehtävä vahvistavat testit, kuten Western blot , jossa käytetään elektroforeesiin perustuvaa tekniikkaa ja jonka virhesuhde on erittäin alhainen.