Rajoitus entsyymi on proteiini , joka kykenee leikkaamaan DNA- fragmentti , jonka tunnusomainen nukleotidin sekvenssin kutsutaan restriktiokohdan . Kukin rajoitus entsyymi siten tunnistaa tietyn sivuston. Tällä hetkellä tunnetaan useita satoja restriktioentsyymejä.
Luonnollisesti läsnä useissa bakteerilajeissa näistä entsyymeistä on tullut tärkeitä välineitä geenitekniikassa .
Bakteerien tuottamat restriktioentsyymit muodostavat puolustusmekanismin bakteriofagien , bakteereille spesifisten virusten, aiheuttamia infektioita vastaan . Kun virus ruiskuttaa DNA: ta bakteereihin, restriktioentsyymi leikkaa sen spesifisissä kohdissaan. Virusgenomin tuhoaminen estää siten infektion. Nimi restriktioentsyymi tulee tästä mekanismista: näiden entsyymien läsnäolo bakteereissa rajoittaa bakteriofagien tarttuvuutta.
Estääkseen restriktioentsyymiä leikkaamasta oman genominsa DNA: ta, bakteerit tuottavat myös toisen entsyymin , jota kutsutaan metylaasiksi , joka tunnistaa myös restriktiokohdan. Metylaasi ei leikkaa DNA: ta, mutta modifioi sen lisäämällä metyyliryhmän yhteen tai useampaan kohdan nukleotidiin . Tämä metylaatio estää restriktioentsyymin pilkkomisen.
Tämä puolustusmekanismi, jota kutsutaan rajoitus- / modifikaatiojärjestelmäksi, yhdistää nämä kaksi entsyymiä järjestelmällisesti, toisen leikkaamiseen ja toisen suojaamiseen.
Rajoitusentsyymit kuuluvat endonukleaasien luokkaan , ts. Entsyymit, jotka kykenevät pilkkomaan kahden nukleotidin väliset fosfodiesterisidokset nukleiinihappoketjussa, ja tarkemmin sanottuna endodeoksiribonukleaasien luokkaan, koska ne ovat spesifisiä DNA: lle. Endonukleaasit eroavat eksonukleaaseista siinä, että ne voivat katkaista nukleiinihapposäikeet sisäisesti, kun taas eksonukleaasit hyökkäävät nukleiinihappomolekyyliä vasta sen päissä.
Rajoitusentsyymit pystyvät tunnistamaan spesifisesti ja vain lyhyen 4 - 10 emäsparin DNA-sekvenssin ja pilkkomaan DNA-dupleksin molemmat säikeet tunnistetussa paikassa. Tätä ominaisuutta on käytetty pitkään molekyylibiologiassa , koska ne mahdollistavat DNA: n pirstoutumisen pienennetyiksi segmenteiksi leikkaamalla määrätyissä paikoissa.
Rajoitusentsyymejä voidaan käyttää DNA-molekyylin geneettisen kartan (nimeltään "restriktiokartta") rakentamiseen. Restriktiokartta antaa restriktiokohtien järjestyksen pitkin tätä molekyyliä ja tuotettujen fragmenttien koon. Tämä 20 vuotta sitten laajalti käytetty nukleiinihappojen karakterisointitekniikka on syrjäytetty suoralla sekvensoinnilla, joka on tullut paljon halvemmaksi ja suoritettu rutiininomaisesti.
Niitä voidaan käyttää myös aiheuttamaan isäntäsolut (esim. Escherichia coli -bakteerit ) tuottamaan eksogeenistä proteiinia . Restriktioentsyymejä on ratkaiseva rooli tässä prosessissa, koska ne mahdollistavat, leikkaamalla säikeestä tiettyyn sijaintiin ja epäsymmetrisesti, integrointia erityinen DNA- lohkoon koodaa spesifistä proteiinia , joka plasmidi varten ilmaista sitä bakteeri . Tämä integraatio voidaan tehdä hyödyntämällä restriktioentsyymin luomaa epäsymmetriaa pelaamalla sekvenssihomologialla pilkkomiskohdassa == integraatiokohta.
Tunnistetun sekvenssin ja pilkkomiskohdan välisestä spatiaalisesta suhteesta riippuen on mahdollista erottaa kolme restriktioentsyymityyppiä.
Tyypin I ja tyypin III entsyymit tunnistavat tietyn DNA-sekvenssin ja leikkaavat satunnaisessa paikassa, noin 1000 emäsparia (emäsparia) erilleen tyypin I kohdalla ja 25 emäsparia tyypin III kohdalla pidemmälle kuin restriktiokohta. Näillä kahdella tyypillä on myös metylaasiaktiivisuus endonukleaasiaktiivisuuden lisäksi, mikä erottaa ne tyypistä II.
Yleisimmin käytetyt tyypin II entsyymit tunnistavat tietyn sekvenssin ja leikkaavat tietyssä paikassa tässä sekvenssissä. Joitakin esimerkkejä näistä entsyymeistä on esitetty alla.
Yleensä restriktioentsyymit estetään etidiummonoatsidilla.
Rajoitusentsyymien nimikkeistö on tarkka. Heidän nimessään on 3 tai 4 kirjainta, jotka vastaavat muun muassa bakteereja, joista tämä entsyymi uutettiin:
Näin meillä E co R I: restriktioentsyymillä ja E scherichia (suku) ko li (laji) kanta R Y317 ensimmäinen, joka on tunnettu siitä, ( I )
Entsyymi | Lähde | Tunnistettu sekvenssi | Leikata | Päättyy (leikkauksen jälkeen) |
Eco RI | Escherichia coli |
5 ' GAATTC 3' CTTAAG |
5 '--- G AATTC --- 3' 3 '--- CTTAA G --- 5' |
Yhtenäinen |
BamHI | Bacillus amyloliquefaciens | 5'GGATCC 3'CCTAGG |
5 '--- G GATCC --- 3' 3 '--- CCTAG G --- 5' |
Yhtenäinen |
HindIII | Haemophilus influenzae | 5'AAGCTT 3'TTCGAA |
5 '--- A AGCTT --- 3' 3 '--- TTCGA A --- 5' |
Yhtenäinen |
MstII | Microcoleus-lajit | 5'CTMTMGG 3'GGAMTCC |
5 '--- CC TNAGG --- 3' 3 '--- GGAMT CC --- 5' |
Yhtenäinen |
TaqI | Thermus aquaticus | 5'TCGA 3'AGCT |
5 '--- T CGA --- 3' 3 '--- AGC T --- 5' |
Yhtenäinen |
Ei | Nocardia otitidis | 5'GCGGCCGC 3'CGCCGGCG |
5 '- GC GGCCGC - 3'
3 '- CGCCGG CG - 5' |
Yhtenäinen |
HinfI | Haemophilus influenzae | 5'GANTC 3'CTNAG |
||
AluI | Arthrobacter luteus | 5'AGCT 3'TCGA |
5 '--- AG CT --- 3' 3 '--- TC GA --- 5' |
Frank |
BgIIII | Bacillus globigii | 5'AGATCT 3'TCTAGA |
5 '--- A GATCT --- 3' 3 '--- TCTAG A --- 5' |
Yhtenäinen |
HaeIII | Haemophilus aegyptius | 5'GGCC 3'CCGG |
5 '--- GG CC --- 3' 3 '--- CC GG --- 5' |
Frank |
HhaI | Haemophilus haemolyticus | 5'GCGC 3'CGCG |
5 '--- GCG C --- 3' 3 '--- C GCG --- 5' |
Yhtenäinen |
PstI | Providencia stuartii | 5'CTGCAG 3'GACGTC |
5 '--- CTGCA G --- 3' 3 '--- G ACGTC --- 5' |
Yhtenäinen |
SmaI | Serratia marcescens | 5'CCCGGG 3'GGGCCC |
5 '--- CCC GGG --- 3' 3 '--- GGG CCC --- 5' |
Frank |
N ja M MstII-sekvenssissä voidaan korvata yhdellä 4 emäksestä ja sen komplementista. MstII: n restriktiosekvenssi on esimerkki epätäydellisestä palindromista, koska sillä on pariton määrä emäsparia.
Entsymaattiset pilkkomiset suoritetaan yleensä mikroputkessa, joka on asetettu vesihauteeseen sopivasti säädetyssä lämpötilassa (yleensä 37 ° C) kelluvalla telineellä.